分子インデックス作成により、定量的標的RNAシーケンスが可能になり、標準的なライブラリの準備における効率が悪いことが明らかになります

定量的標的RNAシーケンスのための単純な分子インデックス法を提示します。これにより、関心のあるmRNAが複雑なcDNAライブラリーから選択的に捕獲され、絶対濃度を決定するためにシーケンスされます。cDNAフラグメントには、各分子がライブラリの準備とシーケンスプロセスを介して元のサンプルから追跡できるように個別にラベル付けされています。同一シーケンスのcDNAフラグメントの複数のコピーは、標識によって異なるようになり、PCR増幅ステップ中に作成された複製クローンを識別し、異なる親分子に割り当てることができます。選択的キャプチャにより、深いサンプリングのためにシーケンスを効率的に使用し、そうでなければ標準シーケンス方法による検出を逃れることができます。また、合成バーコード化されたRNA分子のセットを構築しました。これは、サンプル準備ミックスにコントロールとして導入し、ライブラリー構造の効率を監視するために使用できます。定量的ターゲットシーケンスは、標準的なライブラリ製剤の効率が非常に低いことを明らかにしました。これは、合成バーコードRNA分子を使用してさらに確認されました。この発見は、標準的なライブラリの準備方法により、まれな転写産物が失われ、ライブラリの効率を監視し、より効率的なサンプル調製方法を開発する必要性を強調していることを示しています。

We present a simple molecular indexing method for quantitative targeted RNA sequencing, in which mRNAs of interest are selectively captured from complex cDNA libraries and sequenced to determine their absolute concentrations. cDNA fragments are individually labeled so that each molecule can be tracked from the original sample through the library preparation and sequencing process. Multiple copies of cDNA fragments of identical sequence become distinct through labeling, and replicate clones created during PCR amplification steps can be identified and assigned to their distinct parent molecules. Selective capture enables efficient use of sequencing for deep sampling and for the absolute quantitation of rare or transient transcripts that would otherwise escape detection by standard sequencing methods. We have also constructed a set of synthetic barcoded RNA molecules, which can be introduced as controls into the sample preparation mix and used to monitor the efficiency of library construction. The quantitative targeted sequencing revealed extremely low efficiency in standard library preparations, which were further confirmed by using synthetic barcoded RNA molecules. This finding shows that standard library preparation methods result in the loss of rare transcripts and highlights the need for monitoring library efficiency and for developing more efficient sample preparation methods.