宿主およびウイルスRNAのリボヌクレアーゼLおよび金属イオン非依存性エンドリボヌクレアーゼ切断部位

リボヌクレアーゼL（RNase L）は、抗ウイルスおよび抗菌防御、癌および寿命に関連する金属イオン非依存性エンドリボヌクレアーゼです。RNase Lの生物学的意義にもかかわらず、この酵素によって切断されたRNASはあまり定義されていません。この研究では、深いシーケンス方法を使用して、ホストおよびウイルスRNA内のRNase L切断部位の頻度と位置を明らかにしました。cDNAライブラリを作成するために、RNase Lおよびその他の金属イオン非依存性エンドリボヌクレアーゼによって生成されたRNAフラグメントの端で、2 '、3'環状リン酸を利用しました。精製RNase Lで切断されたウイルスRNASを使用した2 '、3'-環状リン酸cDNA合成およびイルミナシーケンス法を最適化および検証し、ウイルス性RNASおよびポリオウイルスに感染したHELA細胞から精製RNase AおよびRNAを切断したウイルスRNAを使用しました。これらの方法を使用して、（I）RNase Lおよびその他の単一鎖特異的エンドリボヌクレアーゼに深く影響を受けやすい（II）RNase L依存性およびRNase L-非依存性クリーバージ標本部位に深く影響を受けたポリオウイルスRNAゲノムの離散領域を特定しました。RNA（RRNA）および（III）2 '、5S rRNAおよびU6 SnRNAの端にある3'環状リン酸塩。宿主およびウイルスRNA内の金属イオン非依存性エンドリボヌクレアーゼ切断部位の頻度と位置を監視することは、これらの酵素が健康と疾患にどのように寄与するかを部分的に明らかにしています。

Ribonuclease L (RNase L) is a metal-ion-independent endoribonuclease associated with antiviral and antibacterial defense, cancer and lifespan. Despite the biological significance of RNase L, the RNAs cleaved by this enzyme are poorly defined. In this study, we used deep sequencing methods to reveal the frequency and location of RNase L cleavage sites within host and viral RNAs. To make cDNA libraries, we exploited the 2', 3'-cyclic phosphate at the end of RNA fragments produced by RNase L and other metal-ion-independent endoribonucleases. We optimized and validated 2', 3'-cyclic phosphate cDNA synthesis and Illumina sequencing methods using viral RNAs cleaved with purified RNase L, viral RNAs cleaved with purified RNase A and RNA from uninfected and poliovirus-infected HeLa cells. Using these methods, we identified (i) discrete regions of hepatitis C virus and poliovirus RNA genomes that were profoundly susceptible to RNase L and other single-strand specific endoribonucleases, (ii) RNase L-dependent and RNase L-independent cleavage sites within ribosomal RNAs (rRNAs) and (iii) 2', 3'-cyclic phosphates at the ends of 5S rRNA and U6 snRNA. Monitoring the frequency and location of metal-ion-independent endoribonuclease cleavage sites within host and viral RNAs reveals, in part, how these enzymes contribute to health and disease.