マイトマイシンCへの曝露によって示されるように、ヒト脳毛細血管内皮細胞におけるP糖タンパク質の薬物誘発輸送

P糖タンパク質（PGP; ABCB1/MDR1）は、血液脳関門（BBB）の主要な流出輸送体であり、さまざまな化合物の浸透を制限しています。他の組織では、細胞内貯蔵から細胞表面へのPGPの人身売買が実証されており、輸送体の機能的膜挿入により毒性化合物に反応する細胞の迅速な方法を構成する可能性があります。薬物誘発PGPの人身売買がBBBを形成する脳毛細血管内皮細胞でも発生するかどうかは不明です。この研究では、ドキシサイクリン誘導性のMDR1-EGFP融合プラスミドを安定してトランスフェクトしたヒト脳毛細血管内皮細胞（HCMEC/D3）でPGPの人身売買を調査しました。ドキシサイクリンの存在下で、これらの細胞はPGP-EGFP融合タンパク質発現の15倍の増加を示しました。これは、PGP基質ローダミン123（Rho123）の排出の増加に関連していました。化学療法剤マイトマイシンC（MMC）を使用して、PGPの薬物誘発性輸送を研究しました。単一のHCMEC/D3-MDR1-EGFP細胞の共焦点蛍光顕微鏡検査により、細胞内プールから細胞表面へのPGPの再分布がMMC暴露から2時間以内に発生したことが明らかになりました。PGP-EGFPは、膜マイクロドメイン中の融合タンパク質の濃縮領域と互換性のある細胞表面に涙点を示しました。つまり、ルブロール耐性膜のビオチン化細胞表面タンパク質の西部ブロット分析によって確認されました。MMC暴露は、PGP基質（Rho123、Efluxx-ID Gold、Calcein-AM）を使用した3つの機能アッセイで評価されるPGPの機能を増加させました。しかし、この増加は、PGP発現の増加後にある程度の遅延とともに発生し、ルブロール耐性膜複合体からのPGPの放出と一致しました。コレステロールの膜を枯渇させることでラフトを破壊すると、PGPの機能が増加しました。私たちのデータは、人間のBBBでの薬物誘発PGP人身売買の最初の直接的な証拠を提示し、その完全な機能を獲得するためにPGPを脂質ラフトから放出する必要があることを示しています。

P-glycoprotein (Pgp; ABCB1/MDR1) is a major efflux transporter at the blood-brain barrier (BBB), restricting the penetration of various compounds. In other tissues, trafficking of Pgp from subcellular stores to the cell surface has been demonstrated and may constitute a rapid way of the cell to respond to toxic compounds by functional membrane insertion of the transporter. It is not known whether drug-induced Pgp trafficking also occurs in brain capillary endothelial cells that form the BBB. In this study, trafficking of Pgp was investigated in human brain capillary endothelial cells (hCMEC/D3) that were stably transfected with a doxycycline-inducible MDR1-EGFP fusion plasmid. In the presence of doxycycline, these cells exhibited a 15-fold increase in Pgp-EGFP fusion protein expression, which was associated with an increased efflux of the Pgp substrate rhodamine 123 (Rho123). The chemotherapeutic agent mitomycin C (MMC) was used to study drug-induced trafficking of Pgp. Confocal fluorescence microscopy of single hCMEC/D3-MDR1-EGFP cells revealed that Pgp redistribution from intracellular pools to the cell surface occurred within 2 h of MMC exposure. Pgp-EGFP exhibited a punctuate pattern at the cell surface compatible with concentrated regions of the fusion protein in membrane microdomains, i.e., lipid rafts, which was confirmed by Western blot analysis of biotinylated cell surface proteins in Lubrol-resistant membranes. MMC exposure also increased the functionality of Pgp as assessed in three functional assays with Pgp substrates (Rho123, eFluxx-ID Gold, calcein-AM). However, this increase occurred with some delay after the increased Pgp expression and coincided with the release of Pgp from the Lubrol-resistant membrane complexes. Disrupting rafts by depleting the membrane of cholesterol increased the functionality of Pgp. Our data present the first direct evidence of drug-induced Pgp trafficking at the human BBB and indicate that Pgp has to be released from lipid rafts to gain its full functionality.