ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおける4つの必須リシル残基に付着した蛍光プローブ間の近接性共鳴エネルギー伝達研究

トウモロコシの葉から精製されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、蛍光プローブ塩化物によって急速に不活性化されます。活性の喪失は、おそらくリジンのエプシロン-NH2グループのR-NH2グループの共有結合修飾に起因する可能性があります。Tsou [SCIの統計的方法によるデータの分析。罪。11、1535-1558（1962）]は、pH 8 8 r-NH2基を酵素の四量体形態で変更できるという明確な証拠を提供し、そのうち4つは触媒活性に不可欠です。必須グループは、非必須グループの約5倍の速さで変更されています。酵素は、Mg2+とホスホエノールピルビン酸による不活性化から完全に保護されており、その結果、修飾子の必須グループへの結合は完全に廃止されました。したがって、4つの重要なグループは、アクティブサイトまたはその近くにあるように見えました。4つの重要なグループの1つは、塩化ダンシルで修飾され、他の3つはエオシンイソチオシアネートで徐々に修飾されました。二重に標識されたタンパク質では、塩化ダンシル（ドナー）とエオシンイソチオシアネート（アクセプター）の間の非放射単一シングルエネルギー移動が観察されました。3回のサンプル中の特定の受容体の化学量論（0.8-1.1、1.9-2.1、2.9-3.1）で得られたエネルギー移動の効率における低分散（+/- 5％）は、測定された伝達効率が伝達として解釈される可能性があるという信頼を与えました。特定のサイト間。共鳴エネルギー伝達の効率から計算された距離は、ドナー部位から4.8〜5.1 nmの等しく分離された2つのアクセプターサイト、ドナーから6.4 nmの3番目のサイトである2つのアクセプターサイトが明らかになりました。四量体酵素がモノマーに解離する条件下では、タンパク質結合塩化ダンシルとイソチオシアン酸エオシン間の共鳴エネルギーの移動は観察されませんでした。ほとんどの場合、四量体酵素の4つの必須リシル残基は酵素の異なるサブユニットに位置しているため、各サブユニットには、活性に不可欠な1つのリシル残基を持つ基質結合部位が含まれます。

Phosphoenolpyruvate carboxylase, purified from maize leaves, is rapidly inactivated by the fluorescence probe dansyl chloride. The loss of activity can be ascribed to the covalent modification of an R-NH2 group, presumably the epsilon-NH2 group of lysine. Analysis of the data by the statistical method of Tsou [Sci. Sin. 11, 1535-1558 (1962)] provides clear evidence that a pH 8 eight R-NH2 groups can be modified in the tetrameric form of the enzyme, four of which are essential for catalytic activity. Essential groups are modified about five times more rapidly than the non-essential ones. The enzyme was completely protected against inactivation by Mg2+ plus phosphoenolpyruvate and consequently binding of the modifier to the essential groups is completely abolished. Hence the four essential groups seemed to be located at or near the active site(s). One of the four essential groups was modified with dansyl chloride and the other three progressively with eosin isothiocyanate. In the doubly labeled protein non-radiative single-singlet energy transfer between dansyl chloride (donor) and eosin isothiocyanate (acceptor) was observed. The low variance (+/- 5%) in the efficiency of energy transfer obtained at a particular acceptor stoichiometry (0.8-1.1, 1.9-2.1, 2.9-3.1) in triplicate samples provided confidence that the measured transfer efficiency may be interpreted as transfer between specific sites. The distances calculated from the efficiency of resonance energy transfer revealed two acceptor sites, equally separated, 4.8-5.1 nm from the donor site and third site being 6.4 nm apart from the donor. Under conditions where the tetrameric enzyme dissociates into the monomers, no transfer of resonance energy between the protein-bound dansyl chloride and eosin isothiocyanate was observed. Most likely the four essential lysyl residues in the tetrameric enzyme are located in different subunits of the enzyme, hence each of the subunits would contain a substrate-binding site with one lysyl residue crucial for activity.