アミノ酸タグ付けを使用して、環境微生物の新しく合成されたタンパク質のその場の視覚化とクリック化学を使用して

ここでは、環境サンプル内の個々の微生物におけるタンパク質合成の蛍光追跡のための新しいクリック化学法の適用について説明します。この手法は、バイオオートゴーンの非標準アミノ酸タグ付け（BONCAT）と呼ばれ、L-メチオニンのサロゴである非標準的なアミノ酸L-アジドホモアラニン（AHA）のin vivo組み込みに基づいており、AHA-の蛍光標識が続きます。アジド - アルキンによる細胞タンパク質を含むクリック化学。Boncatは、さまざまな系統発生的および生理学的に多様な古細菌および細菌の純粋な培養および濃縮で評価され、経口バイオフィルム、淡水、無酸素堆積物を含む複雑な環境サンプル内の翻訳活性細胞を視覚化するために使用されました。また、ボンカットとリボソームRNA（RRNA）標的蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を結合し、分類学的アイデンティティと翻訳活動の間の直接的なリンクを可能にする結合アッセイを開発しました。さまざまな条件下でインキュベートされたメタノトロフィック濃縮培養を使用して、その場で微生物生理学を研究するBoncat-Fishの可能性を示します。堆積物を帯びた濃縮培養培養内の個々の細胞のナノスケール二次イオン質量分析（（15）NH（3）同化）によるボンカットおよび安定同位体標識を使用したアナボリック活性の直接比較は、AHA陽性細胞と（15）n濃縮。Boncat-Fishは、単一細胞レベルでの環境微生物のin situ活性を研究するための高速で安価で簡単な蛍光顕微鏡法を提供します。

Here we describe the application of a new click chemistry method for fluorescent tracking of protein synthesis in individual microorganisms within environmental samples. This technique, termed bioorthogonal non-canonical amino acid tagging (BONCAT), is based on the in vivo incorporation of the non-canonical amino acid L-azidohomoalanine (AHA), a surrogate for l-methionine, followed by fluorescent labelling of AHA-containing cellular proteins by azide-alkyne click chemistry. BONCAT was evaluated with a range of phylogenetically and physiologically diverse archaeal and bacterial pure cultures and enrichments, and used to visualize translationally active cells within complex environmental samples including an oral biofilm, freshwater and anoxic sediment. We also developed combined assays that couple BONCAT with ribosomal RNA (rRNA)-targeted fluorescence in situ hybridization (FISH), enabling a direct link between taxonomic identity and translational activity. Using a methanotrophic enrichment culture incubated under different conditions, we demonstrate the potential of BONCAT-FISH to study microbial physiology in situ. A direct comparison of anabolic activity using BONCAT and stable isotope labelling by nano-scale secondary ion mass spectrometry ((15)NH(3) assimilation) for individual cells within a sediment-sourced enrichment culture showed concordance between AHA-positive cells and (15)N enrichment. BONCAT-FISH offers a fast, inexpensive and straightforward fluorescence microscopy method for studying the in situ activity of environmental microbes on a single-cell level.