イノシトール1,4,5-三リン酸3-キナーゼAの発現と精製を強化し、PCOLD1-GSTベクターとC末端ヘキサヒスチジンタグを使用して、大腸菌におけるC末端ヘキサヒスチジンタグを使用します

イノシトール1,4,5-三リン酸3-キナーゼA（IP3K-A、代替名：ITPKA）は、1,4,5-三リン酸（IP3）をイノシトール1,3,4,5-に変換するニューロン特異的酵素です。そのキナーゼドメインを介した四小リン酸（IP4）。さらに、IP3K-Aの一時的な過剰発現は、明らかにニューロンの細胞骨格の組織を調節することにより、キナーゼ非依存的な方法で興奮性シナプスの樹状突起棘の形態学的変化を誘導します。精製された組換えIP3K-Aタンパク質の調達は、その生理学的役割の生化学的解明に不可欠であるが、組換えIP3K-Aの生産は、従来の大腸菌発現システムで技術的に挑戦的であることが証明されている。これらの困難は、酵素の溶解度が低いだけでなく、IP3K-Aが部分的なフラグメントに分割される傾向によって引き起こされるタンパク質の品質が低いことに起因しています。現在の研究では、大腸菌の組換えIP3K-Aの発現レベルを強化するために、C末端ヘキサヒスチジンTAG（C-HIS）とともにコールドショック発現ベクター（PCOLD1）を新たに導入しました。重要なことに、他の一般的に雇用されている細菌発現システムと比較すると、PCOLD1システムは、切り捨てられた酵素形態の除外により、全長IP3K-Aの収率と純度を改善し、酵素の溶解度も向上しました。さらに、精製されたIP3K-Aの機能的完全性は、キナーゼ活性アッセイと微小管結合アッセイの両方で確認されました。この修正プロトコルを介して取得した組換えIP3K-Aは、構造的および機能的に酵素の生化学プロファイルの探求を促進することが期待されます。

Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A (IP3K-A, alternative name: ITPKA) is a neuron-specific enzyme that converts 1,4,5-trisphosphate (IP3) into inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate (IP4) through its kinase domain. In addition, transient overexpression of IP3K-A induces morphological changes in dendritic spines of excitatory synapses in a kinase-independent manner, apparently by modulating the organization of the neuronal cytoskeleton. Although the procurement of a purified recombinant IP3K-A protein would be indispensable for the biochemical elucidation of its physiological roles, production of recombinant IP3K-A has proven technically challenging in conventional Escherichia coli expression systems. These difficulties stem from low enzyme solubility, as well as poor protein quality caused by the tendency of IP3K-A to split into partial fragments. In present study, we newly introduced cold-shock expression vector (pCold1) together with a C-terminal hexahistidine tag (C-HIS) to enhance the expression levels of recombinant IP3K-A in E. coli. Importantly, when compared with other commonly-employed bacterial expression systems, the pCold1 system improved the yield and the purity of full-length IP3K-A due to the exclusion of truncated enzyme forms, and also enhanced the solubility of the enzyme. Furthermore, the functional integrity of purified IP3K-A was confirmed in both kinase activity assay and microtubule binding assay. Recombinant IP3K-A acquired via this modified protocol will be expected to facilitate the exploration of the enzyme's biochemical profile, both structurally and functionally.