特定のプロテアソームサブユニットの一時的な過剰発現を介したヒト細胞からの機能的20Sプロテアソームの免疫親和性精製

プロテアソームは、すべての真核細胞のタンパク質分解において中心的な役割を果たすマルチサブユニットのタンパク質分解複合体です。多くの重要な細胞プロセスを調節するため、その機能障害は癌や神経変性を含むさまざまな病理につながる可能性があります。酵素的に活性なプロテアソームの分離は、プロテアソームの調節と機能の成功した研究の重要なステップです。ここでは、3XFLAGでタグ付けされた特定のプロテアソームサブユニットの過渡的な過剰発現後のヒトHEK 293T細胞からの機能的20Sプロテアソームの免疫親和性精製のためのシンプルで効率的なプロトコルについて説明します。3xFLAG融合タンパク質を構築するために、20SプロテアソームサブユニットPSMB5、PSMA5、およびPSMA3をコードするDNA配列を哺乳類発現ベクターPIRES-HRGFP-1Aにクローニングしました。対応する組換えタンパク質PSMB5-3XFLAG、PSMA5-3XFLAG、またはPSMA3-3XFLAGは、ヒトHEK 293T細胞で一時的に過剰発現し、無傷のプロテアソーム複合体に部分的に組み込まれることが示されました。20Sプロテアソームは、旗ペプチドに対する抗体を使用して、軽度の条件下でHEK 293T細胞抽出物から免疫沈降しました。高度に精製された20Sプロテアソームの分離は、さまざまなプロテアソームサブユニットに対する抗体を使用したSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングによって確認されました。アフィニティ精製20Sプロテアソームは、その機能を確認するキモトリプシンおよびトリプシン様ペプチダーゼ活性を持つことが示されました。20Sプロテアソーム精製のこの単純なシングルステップアフィニティ法は、ヒト細胞のプロテアソームのその後の機能的研究に役立つ可能性があります。

The proteasome is a multi-subunit proteolytic complex that plays a central role in protein degradation in all eukaryotic cells. It regulates many vital cellular processes therefore its dysfunction can lead to various pathologies including cancer and neurodegeneration. Isolation of enzymatically active proteasomes is a key step to the successful study of the proteasome regulation and functions. Here we describe a simple and efficient protocol for immunoaffinity purification of the functional 20S proteasomes from human HEK 293T cells after transient overexpression of specific proteasome subunits tagged with 3xFLAG. To construct 3xFLAG-fusion proteins, DNA sequences encoding the 20S proteasome subunits PSMB5, PSMA5, and PSMA3 were cloned into mammalian expression vector pIRES-hrGFP-1a. The corresponding recombinant proteins PSMB5-3xFLAG, PSMA5-3xFLAG, or PSMA3-3xFLAG were transiently overexpressed in human HEK 293T cells and were shown to be partially incorporated into the intact proteasome complexes. 20S proteasomes were immunoprecipitated from HEK 293T cell extracts under mild conditions using antibodies against FLAG peptide. Isolation of highly purified 20S proteasomes were confirmed by SDS-PAGE and Western blotting using antibodies against different proteasome subunits. Affinity purified 20S proteasomes were shown to possess chymotrypsin- and trypsin-like peptidase activities confirming their functionality. This simple single-step affinity method of the 20S proteasome purification can be instrumental to subsequent functional studies of proteasomes in human cells.