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目的：CCR5遺伝子の32 bp欠失多型の配列に近い新しい亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を特徴づけ、CCR5を使用するHIV-1株に耐性のある細胞を生成します。CCR5Δ32は、R5への移動HIV-1に対して遺伝的耐性を提供する自然発生の欠失です。CCR5Δ32配列近くのCCR5遺伝子編集の新たに特定されたターゲットの特異性と有効性は、ターゲットの効果の低下を伴うHIV感染に耐性のある細胞を生成する能力と同様に評価されました。 方法：ZFNCCR5Δ32活性は、ヒトK562細胞のヘテロドゥプレックス形成によって評価されました。ZFNCCR5Δ32特異性の評価は、シリコで分析されました。細胞培養におけるZFNCCR5Δ32の収率は、蛍光活性化細胞の並べ替えによって改善され、ZFNCCR5Δ32の抗HIV効力は、HIV-1株に対するTZM-BL細胞のin vitroで測定されました。 結果：ZFNCCR5Δ32はCCR5Δ32領域を効果的に認識し、CCR5コーディング領域のフレームシフトを誘導し、細胞表面にmRNAとタンパク質のCCR5発現が完全に存在しないことをもたらしました。CCR5ノックアウト細胞は、R5使用株BALによるHIV-1感染に対して耐衝撃性でした。以前のCCR5 ZFN研究とは異なり、新しいZFNには検出可能なオフターゲットアクティビティがありません。 結論：ZFNCCR5Δ32は、CCR5ノックアウトを生成するための特定の効率的なツールです。関連するオフサイト切断イベントがない場合に天然のCCR5Δ32表現型を模倣する能力は、ZFNCCR5Δ32が臨床研究で安全である可能性があることを示唆しています。
目的：CCR5遺伝子の32 bp欠失多型の配列に近い新しい亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を特徴づけ、CCR5を使用するHIV-1株に耐性のある細胞を生成します。CCR5Δ32は、R5への移動HIV-1に対して遺伝的耐性を提供する自然発生の欠失です。CCR5Δ32配列近くのCCR5遺伝子編集の新たに特定されたターゲットの特異性と有効性は、ターゲットの効果の低下を伴うHIV感染に耐性のある細胞を生成する能力と同様に評価されました。 方法：ZFNCCR5Δ32活性は、ヒトK562細胞のヘテロドゥプレックス形成によって評価されました。ZFNCCR5Δ32特異性の評価は、シリコで分析されました。細胞培養におけるZFNCCR5Δ32の収率は、蛍光活性化細胞の並べ替えによって改善され、ZFNCCR5Δ32の抗HIV効力は、HIV-1株に対するTZM-BL細胞のin vitroで測定されました。 結果：ZFNCCR5Δ32はCCR5Δ32領域を効果的に認識し、CCR5コーディング領域のフレームシフトを誘導し、細胞表面にmRNAとタンパク質のCCR5発現が完全に存在しないことをもたらしました。CCR5ノックアウト細胞は、R5使用株BALによるHIV-1感染に対して耐衝撃性でした。以前のCCR5 ZFN研究とは異なり、新しいZFNには検出可能なオフターゲットアクティビティがありません。 結論：ZFNCCR5Δ32は、CCR5ノックアウトを生成するための特定の効率的なツールです。関連するオフサイト切断イベントがない場合に天然のCCR5Δ32表現型を模倣する能力は、ZFNCCR5Δ32が臨床研究で安全である可能性があることを示唆しています。
OBJECTIVES: To characterize a new zinc-finger nuclease (ZFN) that targets close to the sequence of the 32 bp deletion polymorphism in the CCR5 gene, and to generate cells resistant to HIV-1 strains that use CCR5. CCR5Δ32 is a naturally occurring deletion that provides genetic resistance to R5-tropic HIV-1. The specificity and efficacy of a newly identified target for CCR5 gene editing, near the CCR5Δ32 sequence (ZFNCCR5Δ32), was assessed as well as its ability to generate cells resistant to HIV infection with reduced off-target effects. METHODS: ZFNCCR5Δ32 activity was evaluated by heteroduplex formation in human K562 cells. Assessment of ZFNCCR5Δ32 specificity was analysed in silico. The yield of ZFNCCR5Δ32 in cell culture was improved by fluorescence-activated cell sorting, and the anti-HIV potency of ZFNCCR5Δ32 was measured in vitro in TZM-bl cells against HIV-1 strains. RESULTS: ZFNCCR5Δ32 effectively recognized the CCR5Δ32 region, inducing a frameshift of the CCR5 coding region that resulted in the complete absence of CCR5 expression of mRNA and of protein at the cell surface. CCR5 knockout cells were refractory to HIV-1 infection by the R5-using strain BaL. Unlike previous CCR5 ZFN studies, the new ZFN has no detectable off-target activity. CONCLUSIONS: ZFNCCR5Δ32 is a specific and efficient tool for the generation of CCR5 knockouts. Its ability to mimic the natural CCR5Δ32 phenotype in the absence of relevant off-site cutting events suggests that ZFNCCR5Δ32 might be safe in clinical research.
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