[Capsidタンパク質の頂端ループ領域での遺伝子工学によるB型肝炎ウイルス複製への影響]

B型肝炎ウイルス（HBV）DNA複製は、HBV Capsid（HBCまたはCore）タンパク質の180コピーまたは240コピーで構成されるウイルスカプシドで行われます。単量体のコアタンパク質には、コア二量体化とカプシドアセンブリ時にウイルスカプシドの表面にスパイクを形成する頂端ループ領域が含まれています。HBV Capsidのスパイクでの遺伝子工学によるHBV DNA複製への影響を調査する。リンカー融合の強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）またはスパイク領域でのEGFP挿入を短縮して操作したHBCを発現するプラスミドは、制限消化とライゲーション非依存性クローニング（RLIC）によって構築されました。野生型または変異体HBCコンストラクトは、HBC293細胞にそれぞれHBC発現に欠陥がある1.1単位長HBVゲノムを含むプラスミドであるHbv1.1c（ - ）をそれぞれcotransfectedしました。GFPシグナルは蛍光顕微鏡を介して観察され、HBV DNA複製中間体はサザンブロッティングによってアッセイされ、異なる組換え剤の発現と機能を決定しました。我々の結果は、RLIC法がHBCの頂端ループ領域の削除または挿入を生成するのに効果的であることを実証しました。異なるリンカーを持つHBC-EGFP組換え体は、緑色の蛍光を生成しましたが、異なる細胞内分布パターンがありました。ただし、HBV DNA複製は、これら2つのHBC組換え剤の補完化では検出されませんでした。さらに、AA79-80の削除を伴うもののみを含む他の組換え体は、HBV複製をサポートできませんでした。まとめると、我々の結果は、RLICが遺伝子工学に広く適用できる堅牢な方法であることを示唆しています。異なるペプチドリンカーは、操作された融合タンパク質の機能に異なる影響を与える可能性があります。HBC AA79-80は、HBV DNA複製をサポートするためにHBCが重要な役割を果たします。

Hepatitis B virus (HBV) DNA replication takes place in the viral capsid that consists of 180 or 240 copies of HBV capsid (HBc or core) protein. The monomeric core protein contains an apical loop region that forms the spikes on the surface of viral capsid upon core dimerization and capsid assembly. To investigate the impact on HBV DNA replication through gene engineering at the spike of HBV capsid. plasmids expressing engineered HBc with linker-fused enhanced green fluorescent protein (EGFP) or shortened EGFP insertion at the spike region were constructed by Restriction Digestion and Ligation-independent Cloning (RLIC). The wildtype or mutant HBc construct was cotransfected with HBV1.1c(-), a plasmid containing 1.1 unit-length HBV genome with deficiency in HBc expression, into HEK293 cells, respectively. GFP signal was observed through a fluorescence microscope and HBV DNA replicative intermediates were assayed by Southern blotting to determine the expression and functions of different recombinants. Our results demonstrated that the RLIC method was effective to generate deletion or insertion in the apical loop region of HBc. Both HBc-EGFP recombinants with different linkers produced green fluorescence but with different subcellular distribution pattern. However, HBV DNA replication was not detected with the trans-complementation of these two HBc recombinants. In addition, other recombinants including the one only with the deletion of aa79-80 failed to support HBV replication. Taken together, our results suggest that RLIC is a robust method which can be broadly applied in gene engineering; different peptide linkers may have different influences on the functions of an engineered fusion protein; and HBc aa79-80 play a critical role for HBc to support HBV DNA replication.