アラニンスキャン変異誘発によるHGH受容体相互作用の高解像度エピトープマッピング

アラニンスキャン変異誘発と呼ばれる戦略を使用して、ヒト肝臓からクローン化されたHGH受容体への結合を強く調節するヒト成長ホルモン（HGH）の特定の側鎖を特定しました。単一のアラニン変異（合計62）は、受容体認識に関係しているHGH（残基2〜19、54〜74、および167から191）の3つの不連続セグメントに含まれるすべての残基で導入されました。アラニンスキャンは、アラニンに変異するとそれぞれがHGH受容体に対する4倍の低い結合親和性を示したダースの大きな側鎖のクラスターを明らかにしました。HGH受容体への結合を促進するこれらの残基の多くは、HGH受容体にしっかりと結合しないHGH（胎盤乳児やプロラクチンなど）のホモログで変化しています。これらの変異タンパク質の全体的な折り畳みは、7つの異なる立体構造に敏感なモノクローナル抗体を伴う強い交差反応性によって決定されるように、野生型HGHの折りたたみと区別できませんでした。また、アラニンスキャンは、少なくとも片側の鎖であるGlu174を特定しました。これは、アラニンに変異したときに受容体の親和性が4倍以上増加したために結合を妨げました。

A strategy, called alanine-scanning mutagenesis, was used to identify specific side chains in human growth hormone (hGH) that strongly modulate binding to the hGH receptor cloned from human liver. Single alanine mutations (62 in total) were introduced at every residue contained within the three discontinuous segments of hGH (residues 2 to 19, 54 to 74, and 167 to 191) that have been implicated in receptor recognition. The alanine scan revealed a cluster of a dozen large side chains that when mutated to alanine each showed more than a four times lower binding affinity to the hGH receptor. Many of these residues that promote binding to the hGH receptor are altered in homologs of hGH (such as placental lactogens and prolactins) that do not bind tightly to the hGH receptor. The overall folding of these mutant proteins was indistinguishable from that of the wild-type hGH, as determined by strong cross-reactivities with seven different conformationally sensitive monoclonal antibodies. The alanine scan also identified at least one side chain, Glu174, that hindered binding because when it was mutated to alanine the receptor affinity increased by more than a factor of four.