間葉系幹細胞（MSC）におけるピギーバックトランスポゾンを介した安定性導入遺伝子発現の構成プロモーターの特性評価

多能性間葉系幹細胞（MSC）は、自己再生を受ける可能性があり、特定の分化キューの下で多系統を生じさせます。MSCの自己再生と系統のコミットメントが規制される可能性のある分子メカニズムを解明するために、MSCで安定した高レベルの導入遺伝子発現を達成することが頻繁に望ましいです。MSCにおけるレトロウイルスまたはレンチウイルスのベクター媒介遺伝子発現は通常、時間とともに減少します。ここでは、PiggyBacトランスポゾンシステムを使用し、体細胞HEK-293細胞およびMSC IMEF細胞でRFPまたはホタルルシフェラーゼ発現を駆動する能力のために、一般的に使用される6つの構成プロモーターの体系的な比較を実施することを選択します。分析されたプロモーターには、3つのウイルスプロモーター（CMV、CMV-IVS、およびSV40）、1つのハウスキーピング遺伝子プロモーター（UBC）、およびウイルスおよびハウスキーピング遺伝子プロモーター（HEFHおよびCAG-HEFH）の2つの複合プロモーターが含まれます。CMV由来のプロモーターは、HEK-293細胞で最高の導入遺伝子発現を駆動することが示されていますが、これはMSCで大幅に減少しています。逆に、複合プロモーターHefHはMSCで最高の導入遺伝子発現を示しますが、そのプロモーター活性はHEK-293細胞では控えめです。MSCのCMVプロモーターによって駆動される導入遺伝子発現の低下は、少なくとも部分的にはDNAメチル化によって、またはより低い程度はヒストンの脱アセット化によって引き起こされる可能性があります。ただし、HEFHプロモーターは、これらのエピジェネティックな修正によって大きな影響を受けません。まとめると、我々の結果は、HEFH複合プロモーターが、MSCなどの前駆細胞のピギーバックトランスポゾンベクターを使用して長期的かつ高レベルの導入遺伝子発現を駆動する理想的なプロモーターである可能性があることを示しています。

Multipotent mesenchymal stem cells (MSCs) can undergo self-renewal and give rise to multi-lineages under given differentiation cues. It is frequently desirable to achieve a stable and high level of transgene expression in MSCs in order to elucidate possible molecular mechanisms through which MSC self-renewal and lineage commitment are regulated. Retroviral or lentiviral vector-mediated gene expression in MSCs usually decreases over time. Here, we choose to use the piggyBac transposon system and conduct a systematic comparison of six commonly-used constitutive promoters for their abilities to drive RFP or firefly luciferase expression in somatic HEK-293 cells and MSC iMEF cells. The analyzed promoters include three viral promoters (CMV, CMV-IVS, and SV40), one housekeeping gene promoter (UbC), and two composite promoters of viral and housekeeping gene promoters (hEFH and CAG-hEFH). CMV-derived promoters are shown to drive the highest transgene expression in HEK-293 cells, which is however significantly reduced in MSCs. Conversely, the composite promoter hEFH exhibits the highest transgene expression in MSCs whereas its promoter activity is modest in HEK-293 cells. The reduced transgene expression driven by CMV promoters in MSCs may be at least in part caused by DNA methylation, or to a lesser extent histone deacetlyation. However, the hEFH promoter is not significantly affected by these epigenetic modifications. Taken together, our results demonstrate that the hEFH composite promoter may be an ideal promoter to drive long-term and high level transgene expression using the piggyBac transposon vector in progenitor cells such as MSCs.