テザーリガンドを使用した細胞表面受容体の光スイッチ

細胞シグナル伝達の光学的調査と操作は、分離された細胞から生きている動物の無傷の組織に至るまでの生物学的研究に革命をもたらしました。光学操作の有望な道は、化学オプトジェネティクス（または光遺伝学的薬理学）であり、工学固有のタンパク質が光で迅速かつ可逆的にオンとオフになるようにアプローチします。このアプローチは、合成光スイッチリガンドを採用しています。これは、2つの波長の光に応じて2つの立体構造間で前後に切り替えるために可逆的に光異性化することができます。ここでは、PTLがシグナル伝達タンパク質に部位指向の方法で共有結合して結合される光スイッチスイッチのテザーリガンド（PTL）アプローチに焦点を当てています。このために、リガンドアンカーサイトが、リガンドが光制御の立体構造の1つにのみドッキングできるようにする場所に導入されているため、リガンディングを迅速に切り替えることができます。リガンドは、アゴニスト、アンタゴニスト、または活性部位（または毛穴）ブロッカーである可能性があります。原則として、付着の直交化学は、PTLが完全にユニークに固定されます。ただし、リモートコントロールの非常に高い特異性は、リガンドの特異性とリガンディングの正確な幾何学的要件のために、システイン付着によっても得られます。ここでは、光誘導性イオントロピックおよび代謝性グルタミン酸受容体の設計、システイン配置のための部位の選択、PTL付着の方法、および培養細胞における光スイッチング実験の詳細なプロトコルについて説明します。これらの説明は、化学的光遺伝学の応用を他の受容体に導き、より複雑な準備で使用する出発点として機能します。

Optical probing and manipulation of cellular signaling has revolutionized biological studies ranging from isolated cells to intact tissues in the live animal. A promising avenue of optical manipulation is Chemical Optogenetics (or Optogenetic Pharmacology), an approach for engineering specific proteins to be rapidly and reversibly switched on and off with light. The approach employs synthetic photoswitched ligands, which can be reversibly photo-isomerized to toggle back and forth between two conformations in response to two wavelengths of light. We focus here on the photoswitched tethered ligand (PTL) approach in which the PTL is covalently attached in a site-directed manner to a signaling protein. For this a ligand anchoring site is introduced at a location which allows the ligand to dock only in one of the light-controlled conformations, thus enabling liganding to be rapidly switched. The ligand can be an agonist, antagonist or an active site (or pore) blocker. In principle, orthogonal chemistries of attachment would make PTL anchoring completely unique. However, extremely high specificity of remote control is also obtained by cysteine attachment because of the ligand specificity and precise geometric requirements for liganding. We describe here the design of light-gated ionotropic and metabotropic glutamate receptors, the selection of a site for cysteine placement, the method for PTL attachment, and a detailed protocol of photoswitching experiments in cultured cells. These descriptions can guide applications of Chemical Optogenetics to other receptors and serve as a starting point for use in more complex preparations.