イルミナで生成された16S RRNA遺伝子アンプリコン調査の分析、最適化、および検証

16S RRNA遺伝子をシーケンスすることによる微生物群集の探索は、低コストのハイスループットシーケンス機器で拡大しました。Illuminaベースの16S RRNA遺伝子シーケンスは、コストが低く、精度が高く、スループットが大きいため、454の蒸気を超えて人気を獲得しました。最近の報告では、イルミナと454のパイロシーケンスが同様のベータ多様性測定値を提供することが示唆されていますが、既存の454パイロシーケンシングワークフローは、プライマーのシーケンスアダプターを単に変更するだけで454からイルミナMISEQシーケンスに直接転送できることを実証しています。この研究では、16S rRNA遺伝子のV4-V5過可変領域をターゲットにした454の蒸気摂取プライマーを修正して、イルミナシーケンサーと互換性がありました。牛、人間、ヒル、マウス、下水、シロアリ、および模擬コミュニティの微生物群集は、V4-V5領域の454およびMISEQシーケンス、およびV4領域のMISEQシーケンスによって分析されました。私たちの分析により、参照ベースのOTUクラスタリングのみがDe Novoクラスタリングと比較してバイアスを導入し、一部のサンプルで特定の分類群が観察されないことが明らかになりました。これに基づいて、読み取りマージ、汚染物質フィルタリング、および参照ベースのクラスタリングに続いてDe novo OTUクラスタリングがそれに続く分析パイプラインを考案し、推奨します。イルミナシーケンスによるデータセット汚染の低レベルが発見され、非常に敏感なアプローチを必要とする分析に影響を与える可能性があります。イルミナベースのシーケンスプラットフォームに移行することは、微生物の多様性の幅と機能に関するより深い洞察を提供することを約束しますが、我々の結果は、シーケンスと処理のアーティファクトが真の微生物の多様性を曖昧にしないように注意する必要があることを示しています。

The exploration of microbial communities by sequencing 16S rRNA genes has expanded with low-cost, high-throughput sequencing instruments. Illumina-based 16S rRNA gene sequencing has recently gained popularity over 454 pyrosequencing due to its lower costs, higher accuracy and greater throughput. Although recent reports suggest that Illumina and 454 pyrosequencing provide similar beta diversity measures, it remains to be demonstrated that pre-existing 454 pyrosequencing workflows can transfer directly from 454 to Illumina MiSeq sequencing by simply changing the sequencing adapters of the primers. In this study, we modified 454 pyrosequencing primers targeting the V4-V5 hyper-variable regions of the 16S rRNA gene to be compatible with Illumina sequencers. Microbial communities from cows, humans, leeches, mice, sewage, and termites and a mock community were analyzed by 454 and MiSeq sequencing of the V4-V5 region and MiSeq sequencing of the V4 region. Our analysis revealed that reference-based OTU clustering alone introduced biases compared to de novo clustering, preventing certain taxa from being observed in some samples. Based on this we devised and recommend an analysis pipeline that includes read merging, contaminant filtering, and reference-based clustering followed by de novo OTU clustering, which produces diversity measures consistent with de novo OTU clustering analysis. Low levels of dataset contamination with Illumina sequencing were discovered that could affect analyses that require highly sensitive approaches. While moving to Illumina-based sequencing platforms promises to provide deeper insights into the breadth and function of microbial diversity, our results show that care must be taken to ensure that sequencing and processing artifacts do not obscure true microbial diversity.