エラスチン分解およびタンパク質分解酵素

緑膿菌は、少なくとも 7 つの細胞外プロテアーゼを環境に分泌します:シュードライシン (LasB プロテアーゼ; エラスターゼ)、エルギノリシン (アルカリ性プロテイナーゼ)、スタフィロリシン (ブドウ糖分解性エンドペプチダーゼ; LasA プロテアーゼ)、リシル エンドペプチダーゼ (プロテアーゼ IV; PrpL)、PASP (緑膿菌小プロテアーゼ）、LepA（ラージ エキソプロテアーゼ A）、アミノペプチダーゼ。宿主タンパク質に対するそれらの作用は、個別的および相乗的に、緑膿菌感染症の発症において重要な役割を果たします。それらの活性を測定/検出する方法は、それらの生理学的機能、病因における役割、作用機序、調節、および分泌を理解するための基礎となります。タンパク質分解活性の測定/検出のためのほとんどのアッセイでは、基質として修飾/非修飾のカゼインまたはゼラチンが使用されます。定量的アッセイでは、アゾカゼインから生成されたフラグメントがトリクロロ酢酸沈殿によって未消化の基質から分離され、その吸光度が測定されます。非定量的アッセイでは、タンパク質分解活性は、局所的なカゼイン分解により形成されたカゼイン含有固体培地上の細菌増殖または培養上清サンプルの周囲の除去ゾーンとして検出されます。ザイモグラフィーでは、個々のプロテアーゼは、SDS-PAGE による分離、再生、およびタンパク質染色後に、ゼラチン/カゼインを含むゲルで明確なバンドとして検出されます。緑膿菌のエラスチン分解能力は、カゼインの代わりに不溶性エラスチンを含む栄養寒天プレート上の透明ゾーンによって反映されます。黄色ブドウ球菌細胞を芝生として増殖させるミュラー・ヒントン寒天プレートを使用して、黄色ブドウ球菌分離株のスタフィロリシンに対する感受性を評価します。スタフィロリシンを含むサンプルの周囲の透明なゾーンは、黄色ブドウ球菌の増殖が阻害されていることを示します。個々のプロテアーゼの活性を測定する方法は、その切断特異性に基づいています。これらには、エラスチン-コンゴレッドを基質として使用するシュードライシンおよび/またはスタフィロリシンのエラスチン分解活性のアッセイ、黄色ブドウ球菌細胞溶解速度を分光測光法で決定するブドウ糖分解活性の決定方法、およびペプチダーゼ活性の決定方法が含まれます。シュードリシン、スタフィロリシン、リシルエンドペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ。後者の方法は、基質としてプロテアーゼの好ましい切断部位に一致する短いアミノ酸配列を含む発色性または蛍光性のペプチド誘導体を使用する。各基質で切断されるペプチド結合は 1 つだけであるため、これらのアッセイでは速度論的研究が可能です。

Pseudomonas aeruginosa secretes into its environment at least seven extracellular proteases: pseudolysin (LasB protease; elastase), aeruginolysin (alkaline proteinase), staphylolysin (staphylolytic endopeptidase; LasA protease), lysyl endopeptidase (protease IV; PrpL), PASP (P. aeruginosa small protease), LepA (Large ExoProtease A), and an aminopeptidase. Their action on host proteins, both individually and synergistically, plays important roles in pathogenesis of P. aeruginosa infections. Methods to measure/detect their activities are fundamental for understanding their physiological functions, roles in pathogenesis, mechanisms of action, regulation, and secretion. Most assays for determination/detection of proteolytic activity employ modified/non-modified casein or gelatin as substrates. In the quantitative assay, fragments generated from azocasein are separated from undigested substrate by trichloroacetic acid precipitation and their absorbance is measured. In non-quantitative assays, proteolytic activity is detected as clearing zones around bacterial growth or samples of culture supernatants on casein containing solid media formed due to local casein degradation. In zymography, individual proteases are detected as clear bands in gelatin/casein containing gels after SDS-PAGE separation, renaturation and protein staining. The elastinolytic capacity of P. aeruginosa is reflected by clearing zones on nutrient agar plates containing insoluble elastin instead of casein. Mueller-Hinton agar plates on which S. aureus cells are grown as a lawn are used to assess the susceptibility of S. aureus isolates to staphylolysin. A clear zone around a staphylolysin-containing sample indicates inhibition of S. aureus growth. Methods for measuring the activity of individual proteases are based on their cleavage specificity. These include assays of elastinolytic activity of pseudolysin and/or staphylolysin using elastin-Congo red as a substrate, a method for determination of staphylolytic activity in which the rate of S. aureus cell lysis is determined spectrophotometrically, and methods for determination of peptidase activity of pseudolysin, staphylolysin, lysyl endopeptidase, and the aminopeptidase. The latter methods employ chromogenic or fluorogenic peptide derivatives comprising a short amino acid sequence matching the preferred cleavage site of the protease as substrates. As only one peptide bond is cleaved in each substrate, these assays permit kinetic studies.