PMS2遺伝子変異解析：擬似遺伝子干渉を回避するための直接的なcDNAシーケンス

非常に相同性の擬似コピーの存在は、関心のある遺伝子の突然変異分析を損なう可能性があります。特に、PCRベースの戦略を使用する場合、偽遺伝子の共増幅を効果的に防ぐ必要があります。これは、参照シーケンスに従って親遺伝子特異的になるように設計されたプライマーを使用して、厳しいPCR条件を適用することにより、多くの場合に達成されます。ただし、このアプローチが有用性が限られている場合があります。たとえば、PMS2遺伝子がPMS2CLという名前の偽遺伝子の1つとシーケンスを交換することが示されています。これにより、3 '末端および遺伝子由来配列を含む非機能的なPMS2Cl偽遺伝子対立遺伝子に擬似遺伝子由来配列を含む機能性PMS2対立遺伝子が生じます。したがって、パラログは参照シーケンスに従って区別することはできません。この欠点は、直接cDNAシーケンスを使用して効果的に回避できます。このアプローチは、2つのオーバーラップ1.6 kb RT-PCR産物におけるPMS2転写産物の選択的増幅に基づいています。偽遺伝子の共増幅と対立遺伝子のドロップアウトを回避することに加えて、この方法は、ほとんどのDNAベースの変異解析プロトコルの検出から逃れる削除、スプライス変異、およびde novoレトロトランスポゾン挿入を効果的に識別できるという利点もあります。

The presence of highly homologous pseudocopies can compromise the mutation analysis of a gene of interest. In particular, when using PCR-based strategies, pseudogene co-amplification has to be effectively prevented. This is often achieved by using primers designed to be parental gene specific according to the reference sequence and by applying stringent PCR conditions. However, there are cases in which this approach is of limited utility. For example, it has been shown that the PMS2 gene exchanges sequences with one of its pseudogenes, named PMS2CL. This results in functional PMS2 alleles containing pseudogene-derived sequences at their 3'-end and in nonfunctional PMS2CL pseudogene alleles that contain gene-derived sequences. Hence, the paralogues cannot be distinguished according to the reference sequence. This shortcoming can be effectively circumvented by using direct cDNA sequencing. This approach is based on the selective amplification of PMS2 transcripts in two overlapping 1.6-kb RT-PCR products. In addition to avoiding pseudogene co-amplification and allele dropout, this method has also the advantage that it allows to effectively identify deletions, splice mutations, and de novo retrotransposon insertions that escape the detection of most DNA-based mutation analysis protocols.