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植物懸濁液培養で生成された組換えタンパク質は、培地に分泌されると内因性植物プロテアーゼによって劣化し、低い収率をもたらすことがよくあります。プロテアーゼ欠損タバコBY-2細胞株を生成し、配列情報を取得するために、主要な触媒クラスを表すタバコBY-2細胞（NTAP、NTCP、NTMMP1、およびNTSP）から4つの異なるプロテアーゼcDNAをクローン化しました。これらの内因性プロテアーゼに対するアンチセンスRNAの同時発現は、培養サイクルの後期段階で内因性プロテアーゼ発現と活性のレベルが低下した細胞株の確立につながりました。培地中のタンパク質分解活性の低下を示す細胞株の1つは、HIV-1のGP41表面タンパク質を認識して、組換え全長IgG1（κ）抗体2F5の発現に対して選択されました。この細胞株は、2F5重鎖の分解が大幅に減少し、同じ抗体を発現する形質転換された野生型細胞と比較した場合、無傷の抗体重鎖の4倍の蓄積をもたらしました。N末端配列決定データは、抗体にCDR-H3内に2つの切断部位があり、H4フレームワーク領域の終わりに1つの部位があることを明らかにしました。これらの切断部位は、セリンプロテアーゼに対して脆弱であることがわかっています。このデータは、植物細胞懸濁液培養における組換えタンパク質の産生のための植物細胞のさらなる改善の基礎を提供します。
植物懸濁液培養で生成された組換えタンパク質は、培地に分泌されると内因性植物プロテアーゼによって劣化し、低い収率をもたらすことがよくあります。プロテアーゼ欠損タバコBY-2細胞株を生成し、配列情報を取得するために、主要な触媒クラスを表すタバコBY-2細胞（NTAP、NTCP、NTMMP1、およびNTSP）から4つの異なるプロテアーゼcDNAをクローン化しました。これらの内因性プロテアーゼに対するアンチセンスRNAの同時発現は、培養サイクルの後期段階で内因性プロテアーゼ発現と活性のレベルが低下した細胞株の確立につながりました。培地中のタンパク質分解活性の低下を示す細胞株の1つは、HIV-1のGP41表面タンパク質を認識して、組換え全長IgG1（κ）抗体2F5の発現に対して選択されました。この細胞株は、2F5重鎖の分解が大幅に減少し、同じ抗体を発現する形質転換された野生型細胞と比較した場合、無傷の抗体重鎖の4倍の蓄積をもたらしました。N末端配列決定データは、抗体にCDR-H3内に2つの切断部位があり、H4フレームワーク領域の終わりに1つの部位があることを明らかにしました。これらの切断部位は、セリンプロテアーゼに対して脆弱であることがわかっています。このデータは、植物細胞懸濁液培養における組換えタンパク質の産生のための植物細胞のさらなる改善の基礎を提供します。
Recombinant proteins produced in plant suspension cultures are often degraded by endogenous plant proteases when secreted into the medium, resulting in low yields. To generate protease-deficient tobacco BY-2 cell lines and to retrieve the sequence information, we cloned four different protease cDNAs from tobacco BY-2 cells (NtAP, NtCP, NtMMP1, and NtSP), which represent the major catalytic classes. The simultaneous expression of antisense RNAs against these endogenous proteases led to the establishment of cell lines with reduced levels of endogenous protease expression and activity at late stages of the cultivation cycle. One of the cell lines showing reduced proteolytic activity in the culture medium was selected for the expression of the recombinant full-length IgG1(κ) antibody 2F5, recognizing the gp41 surface protein of HIV-1. This cell line showed significantly reduced degradation of the 2F5 heavy chain, resulting in four-fold higher accumulation of the intact antibody heavy chain when compared to transformed wild type cells expressing the same antibody. N-terminal sequencing data revealed that the antibody has two cleavage sites within the CDR-H3 and one site at the end of the H4-framework region. These cleavage sites are found to be vulnerable to serine proteases. The data provide a basis for further improvement of plant cells for the production of recombinant proteins in plant cell suspension cultures.
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