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4β-ヒドロキシコレステロール（4β-HC）は、シトクロムP450 3A4/5活性の新しい内因性バイオマーカーとして提案されています。したがって、ヒト血漿中の正確な決定のための堅牢な方法を持つことが重要です。ここでは、ヒト血漿中の4β-HCの定量のためのエレクトロスプレーイオン化（LC/ESI-MS/MS）アッセイを備えた液体クロマトグラフィータンデム質量分析について説明します。キャリブレーション標準はヒト血漿の代理マトリックスで調製されましたが、発生した研究サンプルを模倣するために、品質制御サンプルがヒト血漿で調製されました。4β-HCの正確な測定を達成するために、その異性体、特に4α-ヒドロキシコレステロール（4α-HC）からの4β-HCのクロマトグラフィー分離が重要でした。この研究の時点で本物の4α-HC標準がない場合、分離を確認するために代替の選択性テスト戦略が開発されました。水酸化カリウムでアルカリ化された後、ヒト血漿サンプル（50μL）をヘキサンで抽出し、ピコリン酸を使用してピコリニルエステルに誘導し、ヘキサンで再び抽出し、LC/ESI-MS/MSによって分析しました。キャリブレーション曲線範囲は5〜500 ng/mLで、クロマトグラフィー分離は、勾配溶出を備えた50×2.1 mmの熱過熱金カラムで達成されました。分析全体のアッセイの精度、精度、直線性、選択性、および分析物の安定性が確立されました。検証済みのアッセイは、ヒト血漿中の4β-HCの測定のために、第I相臨床研究に正常に適用されました。
4β-ヒドロキシコレステロール（4β-HC）は、シトクロムP450 3A4/5活性の新しい内因性バイオマーカーとして提案されています。したがって、ヒト血漿中の正確な決定のための堅牢な方法を持つことが重要です。ここでは、ヒト血漿中の4β-HCの定量のためのエレクトロスプレーイオン化（LC/ESI-MS/MS）アッセイを備えた液体クロマトグラフィータンデム質量分析について説明します。キャリブレーション標準はヒト血漿の代理マトリックスで調製されましたが、発生した研究サンプルを模倣するために、品質制御サンプルがヒト血漿で調製されました。4β-HCの正確な測定を達成するために、その異性体、特に4α-ヒドロキシコレステロール（4α-HC）からの4β-HCのクロマトグラフィー分離が重要でした。この研究の時点で本物の4α-HC標準がない場合、分離を確認するために代替の選択性テスト戦略が開発されました。水酸化カリウムでアルカリ化された後、ヒト血漿サンプル（50μL）をヘキサンで抽出し、ピコリン酸を使用してピコリニルエステルに誘導し、ヘキサンで再び抽出し、LC/ESI-MS/MSによって分析しました。キャリブレーション曲線範囲は5〜500 ng/mLで、クロマトグラフィー分離は、勾配溶出を備えた50×2.1 mmの熱過熱金カラムで達成されました。分析全体のアッセイの精度、精度、直線性、選択性、および分析物の安定性が確立されました。検証済みのアッセイは、ヒト血漿中の4β-HCの測定のために、第I相臨床研究に正常に適用されました。
4β-Hydroxycholesterol (4β-HC) has been proposed as a new endogenous biomarker for cytochrome P450 3A4/5 activity. Therefore, it is important to have a robust method for its accurate determination in human plasma. Here a liquid chromatography-tandem mass spectrometry with electrospray ionization (LC/ESI-MS/MS) assay for the quantitation of 4β-HC in human plasma is described. While the calibration standards were prepared in a surrogate matrix for human plasma, the quality control samples were prepared in human plasma to mimic the incurred study samples. In order to achieve accurate determination of 4β-HC, the chromatographic separation of 4β-HC from its isomers, especially 4α-hydroxycholesterol (4α-HC), was crucial. In the absence of an authentic 4α-HC standard at the time of this study, an alternative selectivity test strategy was developed to confirm the separation. After being alkalized with potassium hydroxide, the human plasma sample (50 μL) was extracted with hexane, derivatized into picolinyl esters using picolinic acid, extracted again with hexane, and then analyzed by LC/ESI-MS/MS. The calibration curve range was 5-500 ng/mL and the chromatographic separation was achieved on a 50 × 2.1 mm Thermal Hypersil Gold column with a gradient elution. The assay accuracy, precision, linearity, selectivity and analyte stability throughout the analysis were established. The validated assay was successfully applied to a Phase I clinical study for the measurement of 4β-HC in human plasma.
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