ハウスキーピング遺伝子の検証と透明細胞腎細胞癌における正常化された遺伝子発現への影響：YBX3/ZONAB/CSDA発現の重要な再評価

背景：YBX3/ZONAB/CSDAは、増殖と分化の密度ベースのスイッチに作用する上皮特異的転写因子です。我々の研究室は、in vitroおよびin vivoでのYBX3調節の幅広い研究の一環として、透明細胞腎細胞眼窩腫（CCRCC）におけるYBX3の過剰発現を報告しました。予備データは5例に制限されており、そのうち3症例のみがペアの正常組織と比較でき、ベータアクチンは遺伝子発現を正常化するための唯一の参照として使用されました。したがって、CCRCCサンプルの大規模なパネルとそれらのペアの健康な組織のリアルタイムPCRによるYBX3発現を再評価することを決定しました。。 結果：遺伝子発現は、16のCCRCCサンプルでRT-QPCRによって測定されましたが、それぞれ対応する健康な組織と比較して、個人間変動を最小限に抑えました。16ペアのサンプル間の発現レベルと安定性について、8つの潜在的なハウスキーピング遺伝子が評価されました。テストされたハウスキーピング遺伝子の中で、特に組み合わせてPPIAとRPS13は、ベータ - アクチン、GAPDH、18S、B2Mなどの古典的な参照遺伝子と比較して、CCRCC組織の遺伝子発現を正常化するのに最適であることが証明されました。このペアを参照として使用すると、16のCCRCC腫瘍のコレクションの中でYBX3発現レベルは、正常な隣接組織と比較して有意に増加しませんでした。しかし、Fuhrmanグレードによる層別化により、低悪性度腫瘍ではYBX3発現レベルが高く、高悪性度腫瘍では低くなりました。免疫ペルオキシダーゼは、低悪性度のYBX3の均一な核染色を確認したが、高悪性度腫瘍で核不均一性を明らかにした。 結論：このホワイトペーパーでは、腫瘍組織のリアルタイムPCR分析の設計における参照遺伝子産物への特別な注意が誤解を招く結論を避けるために重要であることを強調しています。さらに、グローバルYBX3/ZONAB/CSDA mRNA発現レベルは、RCCグレーディングの「署名」内で考慮される可能性があることがわかりました。

BACKGROUND: YBX3/ZONAB/CSDA is an epithelial-specific transcription factor acting in the density-based switch between proliferation and differentiation. Our laboratory reported overexpression of YBX3 in clear cell renal cell arcinoma (ccRCC), as part of a wide study of YBX3 regulation in vitro and in vivo. The preliminary data was limited to 5 cases, of which only 3 could be compared to paired normal tissue, and beta-Actin was used as sole reference to normalize gene expression. We thus decided to re-evaluate YBX3 expression by real-time-PCR in a larger panel of ccRCC samples, and their paired healthy tissue, with special attention on experimental biases such as inter-individual variations, primer specificity, and reference gene for normalization. RESULTS: Gene expression was measured by RT-qPCR in 16 ccRCC samples, each compared to corresponding healthy tissue to minimize inter-individual variations. Eight potential housekeeping genes were evaluated for expression level and stability among the 16-paired samples. Among tested housekeeping genes, PPIA and RPS13, especially in combination, proved best suitable to normalize gene expression in ccRCC tissues as compared to classical reference genes such as beta-Actin, GAPDH, 18S or B2M. Using this pair as reference, YBX3 expression level among a collection of 16 ccRCC tumors was not significantly increased as compared to normal adjacent tissues. However, stratification according to Fuhrman grade disclosed higher YBX3 expression levels in low-grade tumors and lower in high-grade tumors. Immunoperoxidase confirmed homogeneous nuclear staining for YBX3 in low-grade but revealed nuclear heterogeneity in high-grade tumors. CONCLUSIONS: This paper underlines that special attention to reference gene products in the design of real-time PCR analysis of tumoral tissue is crucial to avoid misleading conclusions. Furthermore, we found that global YBX3/ZONAB/CSDA mRNA expression level may be considered within a "signature" of RCC grading.