SELEX中のアプタマー結合の固定領域干渉を排除するための簡単な方法

指数濃縮（SELEX）によるリガンドの系統的進化のための標準ライブラリは、通常、各選択ラウンドから回収されたアプタマーの増幅を促進する隣接領域を利用します。ここでは、これらの隣接シーケンスが、ライブラリシーケンスのランダム領域内に局在するアプタマーの折り畳みまたは関数を妨害する能力に一部起因する選択プロセスにバイアスできることを示します。次に、各隣接領域によるアプタマー干渉をブロックする手段として、相補的なオリゴヌクレオチドの使用を調査することにより、この問題に対処します。等温滴定熱量測定（ITC）研究は、さまざまな干渉メカニズムを定義し、それらを改善するために追加された相補的オリゴヌクレオチドの能力を評価するために、折り畳み予測と組み合わせています。それにより、提案されたブロッキング戦略は洗練され、ヒトα-トロンビン、ストレプトアビジン、および血管内皮成長因子（VEGF）に対するベンチマークアプタマーの標準的なライブラリ形式に適用されます。いずれの場合も、ITCデータは、新しい方法が固定領域を介した干渉効果を効果的に除去し、ベンチマークアプタマーの自然な結合親和性が完全に復元されることを示しています。さらに、選択ライブラリ内で適切に機能するアプタマーの結合親和性は、ブロッキングプロトコルの影響を受けず、この方法を異なる隣接領域シーケンスで構成されるさまざまな一般的なライブラリ形式に適用できることを示します。最後に、保持されたアプタマープールの平均結合親和性を決定するための迅速かつ安価なQPCRベースの方法を提示し、それを使用して、標準のSELEXプロトコルへのプレブロッキング方法の導入により、選択の第1ラウンドで失われる高親和性アプタマーの保持が得られることを示します。それにより、高親和性のアプタマーの利用可能なプールの大幅な濃縮は、最初の数ラウンドで達成されます。したがって、固定領域内または関与する一本鎖（アプタマー様）構造を排除することにより、この手法は、ライブラリメンバーの目的のランダム領域内でアプタマーの配列と機能を分離することが示されているため、他の利用可能なSELEXプロトコルを補完する新しい選択方法を提供します。

Standard libraries for systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) typically utilize flanking regions that facilitate amplification of aptamers recovered from each selection round. Here, we show that these flanking sequences can bias the selection process, due in part to their ability to interfere with the fold or function of aptamers localized within the random region of the library sequence. We then address this problem by investigating the use of complementary oligonucleotides as a means to block aptamer interference by each flanking region. Isothermal titration calorimetry (ITC) studies are combined with fold predictions to both define the various interference mechanisms and assess the ability of added complementary oligonucleotides to ameliorate them. The proposed blocking strategy is thereby refined and then applied to standard library forms of benchmark aptamers against human α-thrombin, streptavidin, and vascular endothelial growth factor (VEGF). In each case, ITC data show that the new method effectively removes fixed-region mediated interference effects so that the natural binding affinity of the benchmark aptamer is completely restored. We further show that the binding affinities of properly functioning aptamers within a selection library are not affected by the blocking protocol, and that the method can be applied to various common library formats comprised of different flanking region sequences. Finally, we present a rapid and inexpensive qPCR-based method for determining the mean binding affinity of retained aptamer pools and use it to show that introduction of the pre-blocking method into the standard SELEX protocol results in retention of high-affinity aptamers that would otherwise be lost during the first round of selection. Significant enrichment of the available pool of high-affinity aptamers is thereby achieved in the first few rounds of selection. By eliminating single-strand (aptamer-like) structures within or involving the fixed regions, the technique is therefore shown to isolate aptamer sequence and function within the desired random region of the library members, and thereby provide a new selection method that is complementary to other available SELEX protocols.