質量分析を使用したコアフコシル化グリコプロテオームの識別のためのステップ断片化とグリカン診断イオンベースのスペクトル精製の戦略

コアフコシル化（CF）は、癌と強い関係を持つタンパク質の特別なグリコシル化パターンです。食品医薬品局（FDA）は、肝細胞癌（HCC）の早期診断のバイオマーカーとして、コアフコシル化α-フェトプロテインを承認しました。コアフコシル化タンパク質を識別するための技術は、かなりの実用的な価値を持っています。コアフコシル化糖タンパク質/グリコペプチド分析の主要な方法は、イオントラップ質量分析による衝突誘導解離（CID）下での中性損失ベースのMS（3）スキャンです。ただし、MS（3）スキャンモードの速度が限られており、低解像度により、ハイスループットを達成することは困難であり、1回の実行で特定されたコアフコシル化タンパク質は数十個しかありません。この作業では、「グリカン診断イオン」ベースのスペクトル最適化を備えた四重極軌道質量分析の1つの新しい特徴である段階的な断片化関数を統合して、大規模にCFグリコペプチドを識別するための新しい戦略を開発しました。段階的な断片化を使用することにより、単純化されたCFグリコペプチドの非常に正確なグリカン情報とペプチド情報の両方を1つのスペクトルで取得することができました。さらに、スペクトルは、従来のMS（2）スキャンと同じ高速で記録できます。「グリカン診断イオン」ベースのスペクトル精製方法を使用することにより、CFグリコペプチド発見の効率が大幅に改善されました。マウス肝臓組織と標準的なCF糖タンパク質でスパイクされたHeLa細胞サンプルのCFグリコプロテオームを分析することにより、私たちの方法の実現可能性と再現性を実証しました。合計で、702および449 CF糖タンパク質に属する1364および856 CFグリコペプチドが、78分間の勾配分析内でそれぞれ同定されました。この作業では、糖系解析で使用する新しい方法の大きな可能性を実証するための実用的な例として、コアフコシル化グリコペプチドを実用的な例として採用しました。また、他の研究分野で柔軟な新規方法を使用することも予想しています。

Core fucosylation (CF) is a special glycosylation pattern of proteins that has a strong relationship with cancer. The Food and Drug Administration (FDA) has approved the core fucosylated α-fetoprotein as a biomarker for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC). The technology for identifying core fucosylated proteins has significant practical value. The major method for core fucosylated glycoprotein/glycopeptide analysis is neutral loss-based MS(3) scanning under collision-induced dissociation (CID) by ion trap mass spectrometry. However, due to the limited speed and low resolution of the MS(3) scan mode, it is difficult to achieve high-throughput, with only dozens of core fucosylated proteins identified in a single run. In this work, we developed a novel strategy for the identification of CF glycopeptides at a large scale, integrating the stepped fragmentation function, one novel feature of quadrupole-orbitrap mass spectrometry, with "glycan diagnostic ion"-based spectrum optimization. By using stepped fragmentation, we were able to obtain both highly accurate glycan and peptide information of a simplified CF glycopeptide in one spectrum. Moreover, the spectrum could be recorded with the same high speed as the conventional MS(2) scan. By using the "glycan diagnostic ion"-based spectrum refinement method, the efficiency of the CF glycopeptide discovery was significantly improved. We demonstrated the feasibility and reproducibility of our method by analyzing CF glycoproteomes of mouse liver tissue and HeLa cell samples spiked with standard CF glycoprotein. In total, 1364 and 856 CF glycopeptides belonging to 702 and 449 CF glycoproteins were identified, respectively, within a 78-min gradient analysis, which was approximately a 7-fold increase in the identification efficiency of CF glycopeptides compared to the currently used method. In this work, we took core fucosylated glycopeptides as a practical example to demonstrate the great potential of our novel method for use in glycoproteome analysis, and we also anticipate using the flexible novel method in other research fields.