FOS/JUNおよびOCTAMER結合タンパク質は、ヒトC-MYC遺伝子の負の要素で共通部位と相互作用します

負の要素は、以前は、ヒトC-MYCプロモーターP1の上流に約300塩基ペア約300ペアの57ベースペアセグメントにローカライズされていました。この要素内で、26塩基のペア領域は、HELA細胞核因子を使用したDNase I消化からin vitroで保護されました。HeLa細胞核抽出物と足跡のある領域にまたがるオリゴヌクレオチドプローブを使用したゲル遅延アッセイで、2つの特異的なDNAタンパク質複合体が同定されました。エキソヌクレアーゼと化学フットプリント分析により、両方の複合体の結合部位がほぼ完全に重複していることが示唆されました。複合体の1つは、既知のAP-1結合部位を所有するオリゴヌクレオチドの競合他社によって排除されました。この同じ複合体は、C-Myc発現を管理する際のC-FOSの役割を示唆する抗FOS免疫グロブリンと強く反応しました。ビーズに固定化されたC-Myc DNAに結合したFOSタンパク質の沈殿により、C-MYCの上流配列との特定の複合体でのC-FOSの関与が確認されました。対照的に、C-MYCプローブで見られる他の複合体は、AP-1結合部位によって競争的に阻害されることができず、抗FOS抗体の影響を受けませんでした。代わりに、この複合体は、免疫グロブリン遺伝子プロモーターに見られるオクタマーDNAモチーフを含む非標識オリゴヌクレオチドによって効率的に排除されました。精製されたオクタマー結合タンパク質は、26塩基対C-Mycシーケンスと安定した複合体を形成しました。これらの結果は、これらの異なる因子のコンセンサス認識シーケンスの縮退により、それぞれがC-Myc負要素に結合できることを示しています。既知の転写活性化因子と負の要素との相互作用は、同じ要因が転写活性化と抑制の両方を媒介できることを示唆しています。

A negative element has previously been localized to a 57-base pair segment approximately 300 base pairs upstream of the human c-myc promoter P1. Within this element, a 26-base pair region was protected in vitro from DNase I digestion with a HeLa cell nuclear factor(s). Two specific DNA-protein complexes were identified in gel retardation assays using HeLa cell nuclear extracts and an oligonucleotide probe spanning the footprinted region. Exonuclease and chemical footprint analyses suggested that the binding sites for both complexes are almost entirely overlapping. One of the complexes was eliminated by oligonucleotide competitors possessing known AP-1 binding sites. This same complex reacted strongly with anti-fos immunoglobulin suggesting a role for c-fos in governing c-myc expression. Precipitation of fos protein bound to c-myc DNA that was immobilized on beads confirmed the involvement of c-fos in a specific complex with the c-myc upstream sequence. In contrast, the other complex seen by the c-myc probe could not be competitively inhibited by AP-1 binding sites and was not affected by anti-fos antibody. Instead, this complex was efficiently eliminated by unlabeled oligonucleotides containing the octamer DNA motif found in immunoglobulin gene promoters. Purified octamer-binding proteins formed stable complexes with the 26-base pair c-myc sequences. These results demonstrate that degeneracy in the consensus recognition sequences of these distinct factors allows each of them to bind the c-myc negative element. The interaction of known transcriptional activators with a negative element suggests that the same factors can mediate both transcriptional activation and repression.