自己複製サブ遺伝子RNAを設計することによるアルファウイルスレプリコンによるタンパク質発現の強化

ウイルスRNAゲノムの感染性cDNAクローンの発生と、in vitro-合成化されたRNAの細胞への送達手段は、アルファウイルスが異種遺伝情報の発現の魅力的なシステムになっています。アルファウイルスは細胞質にのみ複製され、その遺伝物質は細胞DNAで再結合することはできません。アルファウイルスゲノムベースの自己複製RNA（レプリコン）は、異種タンパク質の発現のために広く使用されているベクターです。現在の設計は、異種の関心のあるシーケンスを持つ、サブ遺伝子RNA（SG RNA）によってコードされる構造遺伝子の置換に依存しています。SG RNAは、アルファウイルス特異的RNA複製中間体にあるプロモーターから転写され、さらに増幅されません。この研究では、特にベネズエラの馬脳炎ウイルス（VEEV）ベースのレプリコンからの異種タンパク質の発現レベルを高めるために、アルファウイルス複製とプロモーター構造のメカニズムに関する蓄積された知識を適用しました。VEEV感染中、複製酵素はRNA複製中間体から過剰に産生され、それらの大部分はRNA合成に関与していません。新しく設計されたコンストラクトは、SGプロモーターから転写されるだけでなく、以前に使用されていないVEEV複製酵素によってさらに増幅されるSG RNAをコードします。これらのレプリコンは、従来のデザインを使用しているものよりも10〜50倍効率的に、SG RNAとエンコードされた目的タンパク質を10〜50倍効率的に生成します。西ナイルウイルス（WNV）前後およびエンベロープタンパク質をコードする修正されたレプリコンは、ウサギ下粒子を効率的に生成し、単一の免疫の後、WNVで致死挑戦からマウスを保護する中和抗体の高い力価を引き出しました。

Since the development of infectious cDNA clones of viral RNA genomes and the means of delivery of the in vitro-synthesized RNA into cells, alphaviruses have become an attractive system for expression of heterologous genetic information. Alphaviruses replicate exclusively in the cytoplasm, and their genetic material cannot recombine with cellular DNA. Alphavirus genome-based, self-replicating RNAs (replicons) are widely used vectors for expression of heterologous proteins. Their current design relies on replacement of structural genes, encoded by subgenomic RNAs (SG RNA), with heterologous sequences of interest. The SG RNA is transcribed from a promoter located in the alphavirus-specific RNA replication intermediate and is not further amplified. In this study, we have applied the accumulated knowledge of the mechanism of alphavirus replication and promoter structures, in particular, to increase the expression level of heterologous proteins from Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV)-based replicons. During VEEV infection, replication enzymes are produced in excess to RNA replication intermediates, and a large fraction of them are not involved in RNA synthesis. The newly designed constructs encode SG RNAs, which are not only transcribed from the SG promoter, but are additionally amplified by the previously underused VEEV replication enzymes. These replicons produce SG RNAs and encoded proteins of interest 10- to 50-fold more efficiently than those using a traditional design. A modified replicon encoding West Nile virus (WNV) premembrane and envelope proteins efficiently produced subviral particles and, after a single immunization, elicited high titers of neutralizing antibodies, which protected mice from lethal challenge with WNV.