哺乳動物細胞にグリコシレイテイ可能な緑色蛍光タンパク質を使用したURG7、MRP6₁₀₂、およびSP-Cのライブセルトポロジー評価

タンパク質の膜トポロジーを決定するための実験ツールは、より高い真核生物ではかなり制限されています。ここでは、哺乳類細胞の敏感で多目的な膜トポロジーレポーターとしてのグリコシレーション可能なGFP（GGFP）の使用を報告します。GGFPは、ERルーメンのN結合グリコシル化時に蛍光を選択的に失います。したがって、正の蛍光信号はGGFPの位置をサイトゾルに割り当てますが、GGFPの蛍光信号とグリコシル化状態は、GGFPのERルーメンへの位置をマップします。哺乳類GGFPを使用することにより、疾患関連膜タンパク質の膜トポロジー、URG7、MRP6102、SP-C（VAL）、およびSP-C（LEU）が確認されました。URG7は部分的にERを標的とし、CINの形に挿入されます。MRP6102およびSP-C（LEU/VAL）が膜に挿入されています。標的化されていないSP-Cのわずかな集団は、プロテアソーム依存の品質制御システムによって除去されます。

Experimental tools to determine membrane topology of a protein are rather limited in higher eukaryotic organisms. Here, we report the use of glycosylatable GFP (gGFP) as a sensitive and versatile membrane topology reporter in mammalian cells. gGFP selectively loses its fluorescence upon N-linked glycosylation in the ER lumen. Thus, positive fluorescence signal assigns location of gGFP to the cytosol whereas no fluorescence signal and a glycosylated status of gGFP map the location of gGFP to the ER lumen. By using mammalian gGFP, the membrane topology of disease-associated membrane proteins, URG7, MRP6102, SP-C(Val) and SP-C(Leu) was confirmed. URG7 is partially targeted to the ER, and inserted in Cin form. MRP6102 and SP-C(Leu/Val) are inserted into the membrane in Cout form. A minor population of untargeted SP-C is removed by proteasome dependent quality control system.