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Pseudomonas Protegens PF-5のLipaは、TMHMM 2.0によって予測されるN末端膜貫通ドメインのおかげで、それが膜タンパク質であることを提案していることを提案しており、膜タンパク質に分泌されないことが証明されています。しかし、LIPAは、細胞全細胞、溶解性上着、溶解ペレットのリパーゼ活性に対するLIPAの欠失または過剰発現の効果を決定することにより、細胞内タンパク質であることが確認されました。β-ガラクトシダーゼレポーター株の構築による膜。その後、リパーゼ活性アッセイは、膜貫通ドメインが、LIPAの膜貫通ドメイン配列のマーカーレス欠失変異体の構築とLIPAおよびLIPAΔTMDの発現と精製を通じてLIPAの触媒機能に不可欠な役割を果たしたことを示しました。膜貫通ドメインが膜局在機能を失い、LIPAの触媒機能に大きな影響を与えた理由をさらに調査するために、LipaとLipaΔTMDの3D構造が構築されました。結果は、LIPAの内部に位置する膜貫通ドメインが、αヘリックな蓋がα5ヘリックスの媒介によって開いた立体構造を形成するのを助けたことを示した。それは、サブファミリーI.3リパーゼのβロールモチーフのような一種の分子内シャペロンとして作用するようです。
Pseudomonas Protegens PF-5のLipaは、TMHMM 2.0によって予測されるN末端膜貫通ドメインのおかげで、それが膜タンパク質であることを提案していることを提案しており、膜タンパク質に分泌されないことが証明されています。しかし、LIPAは、細胞全細胞、溶解性上着、溶解ペレットのリパーゼ活性に対するLIPAの欠失または過剰発現の効果を決定することにより、細胞内タンパク質であることが確認されました。β-ガラクトシダーゼレポーター株の構築による膜。その後、リパーゼ活性アッセイは、膜貫通ドメインが、LIPAの膜貫通ドメイン配列のマーカーレス欠失変異体の構築とLIPAおよびLIPAΔTMDの発現と精製を通じてLIPAの触媒機能に不可欠な役割を果たしたことを示しました。膜貫通ドメインが膜局在機能を失い、LIPAの触媒機能に大きな影響を与えた理由をさらに調査するために、LipaとLipaΔTMDの3D構造が構築されました。結果は、LIPAの内部に位置する膜貫通ドメインが、αヘリックな蓋がα5ヘリックスの媒介によって開いた立体構造を形成するのを助けたことを示した。それは、サブファミリーI.3リパーゼのβロールモチーフのような一種の分子内シャペロンとして作用するようです。
LipA from Pseudomonas protegens Pf-5 has been proven not to be secreted into the extracytoplasmic space, proposing that it is a membrane protein in virtue of its N-terminal transmembrane domain predicted by the TMHMM 2.0. However, LipA was confirmed to be an intracellular protein through determining the effects of lipA deletion or overexpression on the lipase activities in the whole-cell, lysis supernatant and lysis pellet, even through its transmembrane domain being able to make heterologous LacZ locate on the cytoplasmic membrane via construction of β-galactosidase reporter strains. Subsequently, lipase activity assays showed that the transmembrane domain played an indispensable role for the catalytic function of LipA through construction of the markerless deletion mutant of transmembrane domain sequence of lipA and the expression and purification of LipA and LipAΔTMD. To further investigate why the transmembrane domain lost its membrane localization function and significantly affected the catalytic function of LipA, the 3D structures of LipA and LipAΔTMD were constructed. The results indicated that the transmembrane domain, located in the interior of LipA, helped the α-helical lid to form an open conformation by the mediation of α5 helix. It seems to act as a kind of intramolecular chaperone like the β-roll motif of subfamily I.3 lipases, which is novel and is the first to notify the intramolecular chaperone of a subfamily I.1 lipase.
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