反復飽和突然変異誘発法：ダーウィン進化を系統的にシミュレートすることでタンパク質をエンジニアリングする強力なアプローチ

反復飽和変異誘発（ISM）は、酵素の効率的な方向性進化に広く適用可能で強力な戦略です。まず、選択した酵素からの1つまたは複数のアミノ酸位置が、マルチレシドサイト（つまり、アミノ酸または「マルチサイト」のグループ）に割り当てられます。次に、各マルチサイトの残基は、すべての標準アミノ酸またはアミノ酸アルファベットの還元に対するユーザー定義のランダム化スキームで変異します。その後、選択したバリアントの遺伝子（通常は最良ですが、必ずしも最良ではありません）は、他のマルチサイトでの飽和変異誘発のテンプレートとして使用され、そのプロセスは、望ましい程度の生体触媒改善が達成されるまで繰り返されます。マルチサイトに対処すると、いわゆるISMスキームまたはさまざまな上向きの枝または経路を持つツリーが繰り返されます。ISMの系統的特性は、ダーウィンの進化の自然プロセス：バリエーション（ライブラリの作成）、選択（ライブラリスクリーニング）、および増幅（次のランダム化のために選択されたテンプレート）をin vitroでシミュレートします。ただし、ISMがタンパク質配列空間の定義されたセグメントの系統的プローブは、ISMがバイオ触媒最適化の点ではるかに効率的であることが示されているため、ISMの他の指向的な進化方法を区別する主な特徴は、タンパク質配列空間の定義されたセグメントの系統的プローブです。エラーが発生しやすいPCR。さらに、ISMの木はまた、エピスタシスの出現に光を当て、それにより、より良い酵素の進化の戦略を合理的に改善しました。ISMは、コンビナトリアルアクティブサイト飽和テスト（CAST）を使用したレート、基質範囲、ステレオおよび位置選択性、およびBファクター反復テスト（B-FIT）を使用する化学的および熱安定性などの触媒特性を改善するために開発されました。ただし、ISMは、タンパク質間相互作用など、他の可能性の中で結合親和性などのタンパク質特性を操作するために呼び出されることもできます。ここでは、ISMの一般的なガイドラインを提供します。これは、モノオキシゲナーゼP450BM3のテストステロンに向けた活性と位置選択性を高めるためのクエストのケーススタディとしてCASTとして使用します。

Iterative saturation mutagenesis (ISM) is a widely applicable and powerful strategy for the efficient directed evolution of enzymes. First, one or more amino acid positions from the chosen enzyme are assigned to multi-residue sites (i.e., groups of amino acids or "multisites"). Then, the residues in each multisite are mutated with a user-defined randomization scheme to all canonical amino acids or a reduced amino acid alphabet. Subsequently, the genes of chosen variants (usually the best but not necessarily) are used as templates for saturation mutagenesis at other multisites, and the process is repeated until the desired degree of biocatalyst improvement has been achieved. Addressing multisites iteratively results in a so-called ISM scheme or tree with various upward branches or pathways. The systematic character of ISM simulates in vitro the natural process of Darwinian evolution: variation (library creation), selection (library screening), and amplification (template chosen for the next round of randomization). However, the main feature of ISM that distinguishes it from other directed evolution methods is the systematic probing of a defined segment of the protein sequence space, as it has been shown that ISM is much more efficient in terms of biocatalyst optimization than random methods such as error-prone PCR. In addition, ISM trees have also shed light on the emergence of epistasis, thereby rationally improving the strategies for evolving better enzymes. ISM was developed to improve catalytic properties such as rate, substrate scope, stereo- and regioselectivity using the Combinatorial Active-site Saturation Test (CAST), as well as chemical and thermal stability employing the B-Factor Iterative Test (B-FIT). However, ISM can also be invoked to manipulate such protein properties as binding affinity among other possibilities, including protein-protein interactions. Herein, we provide general guidelines for ISM, using CAST as the case study in the quest to enhance the activity and regioselectivity of the monooxygenase P450BM3 toward testosterone.