ゼブラフィッシュ胚標本の観察と分析のためのフラットマウントの準備in situハイブリダイゼーション全体で染色

ゼブラフィッシュ胚は現在、発達プロセスの遺伝的制御を調査し、先天性異常をモデル化するために、基本的および生物医学的研究に一般的に使用されています。人生の最初の日に、ゼブラフィッシュ胚は、腎臓、心臓、中枢神経系などの構造の受精、切断、胃変更、セグメンテーション、および器官形成を含む多くの発達段階を経て進行します。若いゼブラフィッシュ胚の解剖学は、胚が丸卵黄腫瘤に関連して発達するため、これらのイベントの多くに関与する組織の視覚化と分析のためのいくつかの課題を提示します。したがって、Tailbudと20の体性段階（受精後10および19時間後（HPF）の10および19時間）の間の固定胚標本の実験的表現型の正確な分析とイメージングのために、in situハイブリダイゼーション全体（希望）を使用して染色されたもの（希望）など、卵子球から胚を除去することがしばしば望ましいです。ただし、フラットマウント手順を実行するのは面倒です。したがって、成功した効率的なフラットマウント準備は、解剖技術の視覚的なデモンストレーションを通じて大いに促進され、最適な組織の取り扱いを支援する試薬を使用することも支援します。ここでは、ゼブラフィッシュ胚における遺伝子発現の1つまたは2色の検出のためのウィッシュプロトコルを提供し、染色された固定試験片のこの例でフラットマウント手順を実行する方法を示します。このフラットマウントプロトコルは、初期のゼブラフィッシュ開発中に出現する多くの胚構造の研究に広く適用され、固定胚サンプルで実行された他の染色方法と併せて実装できます。

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.