ミトコンドリアおよび小胞体で使用するための赤い蛍光遺伝的エンコードCa2+指標

Ca2+は、さまざまなシグナル伝達経路の重要な仲介者であり、小胞体内（ER）内の貯蔵液からの放出と細胞外環境からの流入により、細胞質濃度の動的な変化を受けます。細胞質Ca2+シグナルの調節に加えて、これらの応答はERおよびミトコンドリア内のCa2+の濃度にも影響します。GFPに基づくGCAMPシリーズなどの単一蛍光タンパク質ベースのCa2+指標は、細胞内シグナル伝達経路に関連するCa2+の濃度のイメージングの変化のための強力なツールです。ほとんどのGCAMP型インジケーターには、高いナノモルから低ミクロモル範囲のCa2+の解離定数（KD）があり、したがって細胞質[Ca2+]の測定に最適ですが、ミトコンドリアおよびERでの使用にはあまり適していません。100マイクロモル。現在、24μM（LAR-GECO1）および12μM（LAR-GECO1.2）のKD値を持つように設計された、光学イメージング（LAR-GECO）のGCAMP型低親和性赤色蛍光遺伝的エンコードCa2+指標を報告しています。これらの指標を使用して、いくつかの細胞タイプのミトコンドリアおよびER Ca2+ダイナミクスを画像化できることを実証します。さらに、細胞質GCAMPとERターゲットLAR-GECO1の両方を発現する細胞で、細胞内Ca2+ダイナミクスの2色のイメージングを実行します。これらの低親和性の強度赤蛍光Ca2+指標の開発により、GFPベースの記者と組み合わせてERおよびミトコンドリアCa2+の監視が可能になります。

Ca2+ is a key intermediary in a variety of signalling pathways and undergoes dynamic changes in its cytoplasmic concentration due to release from stores within the endoplasmic reticulum (ER) and influx from the extracellular environment. In addition to regulating cytoplasmic Ca2+ signals, these responses also affect the concentration of Ca2+ within the ER and mitochondria. Single fluorescent protein-based Ca2+ indicators, such as the GCaMP series based on GFP, are powerful tools for imaging changes in the concentration of Ca2+ associated with intracellular signalling pathways. Most GCaMP-type indicators have dissociation constants (Kd) for Ca2+ in the high nanomolar to low micromolar range and are therefore optimal for measuring cytoplasmic [Ca2+], but poorly suited for use in mitochondria and ER where [Ca2+] can reach concentrations of several hundred micromolar. We now report GCaMP-type low-affinity red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for optical imaging (LAR-GECO), engineered to have Kd values of 24 μM (LAR-GECO1) and 12 μM (LAR-GECO1.2). We demonstrate that these indicators can be used to image mitochondrial and ER Ca2+ dynamics in several cell types. In addition, we perform two-colour imaging of intracellular Ca2+ dynamics in cells expressing both cytoplasmic GCaMP and ER-targeted LAR-GECO1. The development of these low-affinity intensiometric red fluorescent Ca2+ indicators enables monitoring of ER and mitochondrial Ca2+ in combination with GFP-based reporters.