質量分析による培養細胞および組織の標的メタボロミクス：メソッド開発と検証

メタボロミクスは、さまざまな環境および遺伝的条件下での生物サンプルにおける小さな生体分子（代謝物）の同定と定量です。質量分析は、選択的反応モニタリング（SRM）による既知の代謝物の標的識別と定量化のためのユニークな機会を提供します。ただし、このアプローチの再現性は、評価される代謝産物のサンプル調製、化学クラス、および安定性を慎重に検討することに依存します。ここでは、液体クロマトグラフィートリプル四重極タンデム質量分析により、培養細胞および組織の標的代謝産物プロファイリングワークフローを導入および検証します。この方法では、水溶性代謝産物のワンステップ抽出と、解糖、アミノ酸、ヌクレオチド、クエン酸サイクル、ヘキソサミン生合成経路を含む中央代謝物の標的分析が必要です。各標的代謝産物の感度、再現性、および分子安定性は、実験条件下で評価されました。ピーク面積比による代謝産物の定量は、最小限の偏差r（2）= 0.98で4倍の動的範囲で希釈して線形であった。細胞および組織を使用した日中および日内精度は、培養細胞株では15％未満の平均変動係数があり、マウス肝組織ではやや高かった。この方法は、3回の測定に適用され、悪性細胞と肝臓の代謝プロファイルに基づいたマウスの飼育類から容易に際立った不死化細胞を識別しました。

Metabolomics is the identification and quantitation of small bio-molecules (metabolites) in biological samples under various environmental and genetic conditions. Mass spectrometry provides the unique opportunity for targeted identification and quantification of known metabolites by selective reaction monitoring (SRM). However, reproducibility of this approach depends on careful consideration of sample preparation, chemical classes, and stability of metabolites to be evaluated. Herein, we introduce and validate a targeted metabolite profiling workflow for cultured cells and tissues by liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry. The method requires a one-step extraction of water-soluble metabolites and targeted analysis of central metabolites that include glycolysis, amino acids, nucleotides, citric acid cycle, and the hexosamine biosynthetic pathway. The sensitivity, reproducibility and molecular stability of each targeted metabolite were assessed under experimental conditions. Quantitation of metabolites by peak area ratio was linear with a dilution over a 4 fold dynamic range with minimal deviation R(2)=0.98. Inter- and intra-day precision with cells and tissues had an average coefficient of variation <15% for cultured cell lines, and somewhat higher for mouse liver tissues. The method applied in triplicate measurements readily distinguished immortalized cells from malignant cells, as well as mouse littermates based on their hepatic metabolic profiles.