RAB11Aを含むリサイクルシステム内のホスファチジルセリン局在の明確なパターン

RAB11 GTPaseおよびRab11ファミリー相互作用タンパク質（RAB11-FIPS）は、ゆっくりとリサイクル経路内の統合されているが異なるコンパートメントを定義します。これらのコンパートメントの脂質含有量はあまり理解されていませんが、過去の研究はホスファチジルセリン（PS）がリサイクル膜の不可欠な成分であることを示しています。RABおよびRAB11-FIPを含む膜内のPSの存在における重要な違いを特定しようとしました。ライブ細胞蛍光顕微鏡と構造化された照明顕微鏡を使用して、PSの以前に公開されたLACTC2プローブが、さまざまなRAB GTPaseとRab11-Fipsとのオーバーラップの微分パターンを表示するかどうかを判断しました。HeLa細胞に共発現すると、LACTC2プローブとRAB GTPaseの間に選択的なオーバーラップが観察されました。RAB11-FIP1タンパク質は、末梢および末梢コンパートメントに沿ってLACTC2と一貫して重複しています。RAB11-FIP1とLACTC2との関連性の特異性は、追加のRAB11-FIPS（FIP2、FIP3、およびFIP5）がコンパートメントを含むLACTC2との選択的関連を示したことを実証することにより、さらに確認されました。LACTC2を使用したRAB11-FIPSのライブセルデュアル発現研究は、RAB11A依存リサイクルシステムの管状コンパートメントに沿ってPSが濃縮されることを示しました。さらに、RAB11-FIPSからのC2ドメインの除去により、腹部環境領域にLACTC2プローブが蓄積することがわかり、リサイクルシステムを介した人身売買の阻害が細胞内のPSの分布に影響を与える可能性があることがわかりました。最後に、構造化された照明顕微鏡を使用してこれらの発見を確認し、重複する蛍光シグナルが同じ膜上にあることを示唆しました。これらの結果は、RAB GTPaseとRab11-FipsとPSを含むリサイクルシステム膜ドメインとの明確な関連性を示唆しています。

The Rab11 GTPases and Rab11 family-interacting proteins (Rab11-FIPs) define integrated yet distinct compartments within the slow recycling pathway. The lipid content of these compartments is less well understood, although past studies have indicated phosphatidylserine (PS) is an integral component of recycling membranes. We sought to identify key differences in the presence of PS within Rab and Rab11-FIP containing membranes. We used live cell fluorescence microscopy and structured illumination microscopy to determine whether the previously published LactC2 probe for PS displays differential patterns of overlap with various Rab GTPases and Rab11-FIPs. Selective overlap was observed between the LactC2 probe and Rab GTPases when co-expressed in HeLa cells. Rab11-FIP1 proteins consistently overlapped with LactC2 along peripheral and pericentriolar compartments. The specificity of Rab11-FIP1 association with LactC2 was further confirmed by demonstrating that additional Rab11-FIPs (FIP2, FIP3, and FIP5) exhibited selective association with LactC2 containing compartments. Live cell dual expression studies of Rab11-FIPs with LactC2 indicated that PS is enriched along tubular compartments of the Rab11a-dependent recycling system. Additionally, we found that the removal of C2 domains from the Rab11-FIPs induced an accumulation of LactC2 probe in the pericentriolar region, suggesting that inhibition of trafficking through the recycling system can influence the distribution of PS within cells. Finally, we confirmed these findings using structured illumination microscopy suggesting that the overlapping fluorescent signals were on the same membranes. These results suggest distinct associations of Rab GTPases and Rab11-FIPs with PS-containing recycling system membrane domains.