腎上皮細胞におけるRCKキナーゼICKおよびMOKによる繊毛の長さとフラゲラ輸送の調節

一次繊毛は重要な感覚器官です。それらはさまざまな長さで存在し、異なる細胞特異的機能を反映する可能性があります。繊毛の長さがどのように調節されるかは不明ですが、おそらく毛様体軸索に沿ってタンパク質複合体を輸送するフラゲラ輸送（IFT）が含まれます。さまざまな生物の研究により、ROSクロスハイブリダイジングキナーゼ（RCK）の小規模で保存されたファミリーが繊毛長の調節因子として特定されています。ここでは、このファミリーの2人のメンバーである腸細胞キナーゼ（ICK）とMAPK/MAK/MRKオーバーラップキナーゼ（MOK）がマウス腎上皮（IMCD-3）細胞の繊毛に局在し、繊毛の長さを負に調節することを示します。IFT機構に対するICKとMOKの効果を分析するために、5つの蛍光タグ付けされたIFTタンパク質のライブイメージングをセットアップします：KINESIN-IIのサブユニットであるKIF3B、主要な順序IFTモーター、複雑なタンパク質IFT43、複合体Bタンパク質IFT20、BBSOMEタンパク質BBS8およびホモダイマーキネシンKIF17。哺乳類の繊毛での機能は不明です。興味深いことに、5つのタンパク質はすべて、順行性および逆行性の方向に約0.45 µm/sで移動し、それらはすべて同じ機械で輸送されていることを示唆しています。さらに、GFPはICKとMOKのタグ付けされたタグ付けで、IFTタンパク質と同様の速度で移動し、IFT機構の一部であるか、IFT機構によって輸送されていることを示唆しています。実際、ICKの喪失または機能獲得はIFT速度に影響を与えます。ノックダウンは順行性速度を増加させましたが、過剰発現は逆行速度を低下させました。対照的に、MOKノックダウンまたは過剰発現はIFT速度に影響しませんでした。最後に、ICKまたはMOKノックダウンの繊毛の長さとIFTのノックダウンの効果は、ラパマイシン治療によって抑制されることがわかり、これらの効果にはMTORC1経路が必要であることが示唆されています。我々の結果は、繊毛の長さとIFTの調節因子としてのRCKキナーゼの重要性を確認しています。ただし、我々の結果の一部は、繊毛の長さとIFT速度の間の直接的な相関を示唆しているのに対し、他の結果は、繊毛の長さがIFT速度とは無関係に変調できることを示しています。

Primary cilia are important sensory organelles. They exist in a wide variety of lengths, which could reflect different cell-specific functions. How cilium length is regulated is unclear, but it probably involves intraflagellar transport (IFT), which transports protein complexes along the ciliary axoneme. Studies in various organisms have identified the small, conserved family of ros-cross hybridizing kinases (RCK) as regulators of cilium length. Here we show that Intestinal Cell Kinase (ICK) and MAPK/MAK/MRK overlapping kinase (MOK), two members of this family, localize to cilia of mouse renal epithelial (IMCD-3) cells and negatively regulate cilium length. To analyze the effects of ICK and MOK on the IFT machinery, we set up live imaging of five fluorescently tagged IFT proteins: KIF3B, a subunit of kinesin-II, the main anterograde IFT motor, complex A protein IFT43, complex B protein IFT20, BBSome protein BBS8 and homodimeric kinesin KIF17, whose function in mammalian cilia is unclear. Interestingly, all five proteins moved at ∼0.45 µm/s in anterograde and retrograde direction, suggesting they are all transported by the same machinery. Moreover, GFP tagged ICK and MOK moved at similar velocities as the IFT proteins, suggesting they are part of, or transported by the IFT machinery. Indeed, loss- or gain-of-function of ICK affected IFT speeds: knockdown increased anterograde velocities, whereas overexpression reduced retrograde speed. In contrast, MOK knockdown or overexpression did not affect IFT speeds. Finally, we found that the effects of ICK or MOK knockdown on cilium length and IFT are suppressed by rapamycin treatment, suggesting that these effects require the mTORC1 pathway. Our results confirm the importance of RCK kinases as regulators of cilium length and IFT. However, whereas some of our results suggest a direct correlation between cilium length and IFT speed, other results indicate that cilium length can be modulated independent of IFT speed.