デュシェンヌ筋ジストロフィー患者のサンプル中の個々の繊維におけるジストロフィンの敏感で再現性のある客観的免疫蛍光分析方法

デュシェンヌ筋ジストロフィー（DMD）は、筋肉繊維の筋細胞膜膜の内面にジストロフィン発現の欠如または低下が特徴です。ジストロフィンレベルを上げることを目的とした治療アプローチの臨床開発には、DMD患者の筋肉生検でのジストロフィン発現の違いの敏感で再現可能な測定が必要です。ただし、これは、生検全体にわたるリバリバトファイバーと低微量ジストロフィン発現の発生におけるドナー内およびドナー間の分散により、技術的な課題をもたらします。筋肉生検での繊維全体の繊維全体の個々の繊維あたりの筋細胞膜ジストロフィン強度を測定する免疫蛍光および半自動画像解析法を開発しました。ジストロフィンとスペクトリン用に共染色された筋肉の断面は、共焦点顕微鏡によって画像化されており、Definiensソフトウェアを使用して画像分析を実施しました。ジストロフィン強度は、個々の筋肉繊維ごとのスペクトリンの筋細胞膜マスクで測定されており、複数の膜強度パラメーター（平均、最大、繊維あたりの分位）が計算されました。ヒストグラムは、生検の繊維集団のジストロフィン強度の分布を描写できます。この方法は、DMD、ベッカー筋ジストロフィー、および健康な筋肉サンプルのジストロフィンを測定することによりテストされました。同じまたは複数日のDMD生検の重複または四次数の分析、異なる演算子による、または異なる抗体を使用したものは、客観的で再現性があることが示されました（アッセイ間精度、CV 2-17％およびAssay Inter Assay Precision、CV2-10％）。さらに、この方法は、治療化合物で治療する前後にDMD患者からの2つの生検の間のジストロフィンの一貫した小さな違いを検出するのに十分に敏感でした。

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is characterized by the absence or reduced levels of dystrophin expression on the inner surface of the sarcolemmal membrane of muscle fibers. Clinical development of therapeutic approaches aiming to increase dystrophin levels requires sensitive and reproducible measurement of differences in dystrophin expression in muscle biopsies of treated patients with DMD. This, however, poses a technical challenge due to intra- and inter-donor variance in the occurrence of revertant fibers and low trace dystrophin expression throughout the biopsies. We have developed an immunofluorescence and semi-automated image analysis method that measures the sarcolemmal dystrophin intensity per individual fiber for the entire fiber population in a muscle biopsy. Cross-sections of muscle co-stained for dystrophin and spectrin have been imaged by confocal microscopy, and image analysis was performed using Definiens software. Dystrophin intensity has been measured in the sarcolemmal mask of spectrin for each individual muscle fiber and multiple membrane intensity parameters (mean, maximum, quantiles per fiber) were calculated. A histogram can depict the distribution of dystrophin intensities for the fiber population in the biopsy. This method was tested by measuring dystrophin in DMD, Becker muscular dystrophy, and healthy muscle samples. Analysis of duplicate or quadruplicate sections of DMD biopsies on the same or multiple days, by different operators, or using different antibodies, was shown to be objective and reproducible (inter-assay precision, CV 2-17% and intra-assay precision, CV 2-10%). Moreover, the method was sufficiently sensitive to detect consistently small differences in dystrophin between two biopsies from a patient with DMD before and after treatment with an investigational compound.