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血管内皮成長因子（VEGF）は、腫瘍の血管新生に重要な役割を果たしている非常に特異的な血管新生因子です。抗血管新生剤は、腫瘍細胞の成長と転移を阻害する可能性があります。シングルチェーン可変フラグメント（SCFV）は、抗体全体と同じ親和性とサイズが小さいため、組織の透過性が向上し、生産収量が高くなります。この研究では、血管新生を阻害するVEGFに対してヒトSCFV抗体を分離することを目指しています。そのために、ヒトSCFVファージライブラリーを使用して、VEGFの結合部位に対して特定のSCFV抗体を分離しました。ヒトSCFVファージライブラリーは、製造プロトコルに従って増幅され、組換えVEGFに対してパン化されました。SCFV抗体は、5ラウンドのパン後に分離されました。ファージELISAは、最高のアフィニティバインダー（HR6）の検出に使用されました。可溶性HR6 SCFVは、大腸菌HB2151の非抑制因子株で発現し、NI-NTAクロマトグラフィーを使用して精製しました。HR6 SCFVのin vivoおよびin vitro機能は、VEGF刺激HUVECでの絨毛膜膜アッセイおよび内皮細胞増殖アッセイによって分析されました。交差反応性の結果は、HR6 SCFVがVEGFに特異的に境界線を及ぼすことを示しました。親和性は1.8×10（-7）mと計算されました。HR6は、コリオアラント膜アッセイで10μgのHR6を使用して、用量依存的な方法でHuvecの増殖を止め、抗血管新生活性が観察されました。この作業では、ヒトライブラリファージディスプレイから選択されたHR6 SCFVがVEGFシグナル伝達を特異的にブロックすることを実証します。さらに、このSCFVは抗血管新生効果があり、そのサイズが小さいため、組織拡散が拡大します。HR6抗体はヒトライブラリーを形成したため、ヒトにとって免疫原性ではなく、癌の潜在的な治療薬として役立つ可能性があります。
血管内皮成長因子（VEGF）は、腫瘍の血管新生に重要な役割を果たしている非常に特異的な血管新生因子です。抗血管新生剤は、腫瘍細胞の成長と転移を阻害する可能性があります。シングルチェーン可変フラグメント（SCFV）は、抗体全体と同じ親和性とサイズが小さいため、組織の透過性が向上し、生産収量が高くなります。この研究では、血管新生を阻害するVEGFに対してヒトSCFV抗体を分離することを目指しています。そのために、ヒトSCFVファージライブラリーを使用して、VEGFの結合部位に対して特定のSCFV抗体を分離しました。ヒトSCFVファージライブラリーは、製造プロトコルに従って増幅され、組換えVEGFに対してパン化されました。SCFV抗体は、5ラウンドのパン後に分離されました。ファージELISAは、最高のアフィニティバインダー（HR6）の検出に使用されました。可溶性HR6 SCFVは、大腸菌HB2151の非抑制因子株で発現し、NI-NTAクロマトグラフィーを使用して精製しました。HR6 SCFVのin vivoおよびin vitro機能は、VEGF刺激HUVECでの絨毛膜膜アッセイおよび内皮細胞増殖アッセイによって分析されました。交差反応性の結果は、HR6 SCFVがVEGFに特異的に境界線を及ぼすことを示しました。親和性は1.8×10（-7）mと計算されました。HR6は、コリオアラント膜アッセイで10μgのHR6を使用して、用量依存的な方法でHuvecの増殖を止め、抗血管新生活性が観察されました。この作業では、ヒトライブラリファージディスプレイから選択されたHR6 SCFVがVEGFシグナル伝達を特異的にブロックすることを実証します。さらに、このSCFVは抗血管新生効果があり、そのサイズが小さいため、組織拡散が拡大します。HR6抗体はヒトライブラリーを形成したため、ヒトにとって免疫原性ではなく、癌の潜在的な治療薬として役立つ可能性があります。
Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a highly specific angiogenesis factor which has crucial roles in the angiogenesis of tumors. Anti-angiogenesis agents can inhibit growth and metastasis of tumor cells. Single-chain variable fragments (scFv) have the same affinity as whole antibodies and smaller size, thus result in more tissue permeability and higher production yield. In this research we aim to isolate a human scFv antibody against VEGF that inhibits angiogenesis. For that, we have used human scFv phage library to isolate a specific scFv antibody against binding site of VEGF. The human scFv phage library was amplified according to the manufacture protocol and panned against recombinant VEGF. ScFv antibody was isolated after five rounds of panning. Phage ELISA was used for detection of the highest affinity binder (HR6). Soluble HR6 scFv was expressed in non-suppressor strain of Escherichia coli HB2151 and purified using Ni-NTA chromatography. In vivo and in vitro function of the HR6 scFv was analyzed by chorioallantoic membrane assay and endothelial cell proliferation assay on VEGF stimulated HUVECs. Result of the cross reactivity showed that HR6 scFv specifically bounds to VEGF. The affinity was calculated to be 1.8×10(-7)M. HR6 could stop HUVEC proliferation in a dose dependent manner and anti-angiogenesis activity was observed using 10μg of HR6 in chorioallantoic membrane assay. In this work, we demonstrate that a HR6 scFv selected from human library phage display specifically blocks VEGF signaling, furthermore, this scFv has an anti-angiogenesis effect and because of its small size has more tissue diffusion. The HR6 antibody was isolated form a human library thus, it is not immunogenic for humans and could serve as a potential therapeutic agent in cancer.
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