STRA8およびC-KIT遺伝子の発現状態を監視するための二重特異的プロモーターシステムの構造と定量的評価

レポーター遺伝子と融合し、細胞内のさまざまなイベントの同時モニタリングと融合した複数のプロモーターを備えた遺伝的構築物の応用は、近年特別な注目を集めています。特徴的な特性を備えたレンチウイルスベクターは、in vitroで細胞の発達的変化を監視するために考えられています。この研究では、2つの生殖細胞特異的プロモーター（STRA8およびC-KIT）を含む新規レンチウイルスベクター（FUM-M）を構築し、ZSGREENおよびDSRED2レポーター遺伝子と融合し、レティノ酸およびDMSOでの治療後の異なる細胞での効率を評価しました。いくつかの細胞株（P19、GC-1 SPG、およびHEK293T）にこのベクターで導入され、プロモーターの機能能力はフローサイトメトリーと定量的RT-PCRによって検証されました。我々の結果は、FUM-Mが外因性因子の存在下および非存在下で動的な挙動を示すことを示しています。また、細胞内のSTRA8およびC-KIT mRNAの内因性レベルに存在するプロモーターの機能と、細胞内の内因性レベルの間にも相関が観察されました。結論として、この戦略は、生殖細胞への細胞分化に関与する化学誘導者をスクリーニングするための有益かつ実用的な方法として、コンストラクトをさらに最適化する必要があるこの戦略を推奨します。

Applications of genetic constructs with multiple promoters, which are fused with reporter genes and simultaneous monitoring of various events in cells, have gained special attention in recent years. Lentiviral vectors, with their distinctive characteristics, have been considered to monitor the developmental changes of cells in vitro. In this study, we constructed a novel lentiviral vector (FUM-M), containing two germ cell-specific promoters (Stra8 and c-kit), fused with ZsGreen and DsRed2 reporter genes, and evaluated its efficiency in different cells following treatments with retinoic acid and DMSO. Several cell lines (P19, GC-1 spg and HEK293T) were transduced with this vector, and functional capabilities of the promoters were verified by flow cytometry and quantitative RT-PCR. Our results indicate that FUM-M shows dynamic behavior in the presence and absence of extrinsic factors. A correlation was also observed between the function of promoters, present in the lentiviral construct and the endogenous level of the Stra8 and c-kit mRNAs in the cells. In conclusion, we recommend this strategy, which needs further optimization of the constructs, as a beneficial and practical way to screen chemical inducers involved in cellular differentiation toward germ-like cells.