DNAホスホロチオエート修飾に関与するDNDEのin vivo変異特性

DNAホスホロチオエート（PT）修飾は、原核生物DNAの糖リン酸骨格で発生する最近同定されたエピジェネティックな修飾です。以前の研究では、DNA PT修飾が5つのDNDABCDEタンパク質によって配列選択的およびRPステレオ固有の方法で支配されることが実証されています。バクテリアは、制限修正システムとしてDNDFGHとともにこの生理学的修飾を取得した可能性があります。しかし、PT修飾経路におけるDNDタンパク質、特に最小タンパク質DNDEの生物学的機能についてはほとんど知られていない。dndeは、in vitroでニックされたdsDNAを好むDNA結合タンパク質であると報告されました。DNDEのDNAへの結合は、その表面上の6つの正に帯電したリジン残基を介して発生します。これらの重要なリジン残基の置換​​により、DNDEタンパク質のDNA結合親和性が検出不能なレベルに大幅に減少しました。この研究では、プラスミド上のDNDEの部位指向変異誘発を実施し、質量分析による生理学的条件下でDNA PT修飾を測定しました。in vitro結合アッセイとの特徴的な違いが観察されました。アラニンに変異したリジン残基を持ついくつかの変異体は、PT修飾の総頻度を減少させましたが、PT修飾を完全に排除する変異体はありませんでした。我々の結果は、DNDEのニック付きDSDNA結合能力がPT修飾には不可欠ではない可能性があることを示唆しており、および/またはDNDEがDSDNAへの結合に加えて他の生物学的機能を持っている可能性があることを示唆しています。

DNA phosphorothioate (PT) modification is a recently identified epigenetic modification that occurs in the sugar-phosphate backbone of prokaryotic DNA. Previous studies have demonstrated that DNA PT modification is governed by the five DndABCDE proteins in a sequence-selective and RP stereo-specific manner. Bacteria may have acquired this physiological modification along with dndFGH as a restriction-modification system. However, little is known about the biological function of Dnd proteins, especially the smallest protein, DndE, in the PT modification pathway. DndE was reported to be a DNA-binding protein with a preference for nicked dsDNA in vitro; the binding of DndE to DNA occurs via six positively charged lysine residues on its surface. The substitution of these key lysine residues significantly decreased the DNA binding affinities of DndE proteins to undetectable levels. In this study, we conducted site-directed mutagenesis of dndE on a plasmid and measured DNA PT modifications under physiological conditions by mass spectrometry. We observed distinctive differences from the in vitro binding assays. Several mutants with lysine residues mutated to alanine decreased the total frequency of PT modifications, but none of the mutants completely eliminated PT modification. Our results suggest that the nicked dsDNA-binding capacity of DndE may not be crucial for PT modification and/or that DndE may have other biological functions in addition to binding to dsDNA.