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目的：肥沃度の保存戦略は、生存可能な卵胞によって組み込まれた中性赤（NR）で染色するなど、前腹部卵胞（PAF）の非侵襲的実行可能性評価を保証します。手順を最適化するために、最初に、孤立したウシPAFの最適な生存率スクリーニングに必要な最低濃度と最短の暴露時間を決定しました。第二に、このプロトコルをガラス化手順と組み合わせて、染色された卵胞の極性耐性を評価しました。 方法：分離されたPAF（900、6回以上の複製）を、DMEM/HAMのF12（培地中-cm）で4日間（38.5°C、5％CO2）培養しました。D0、D2、およびD4では、卵胞を染色し、NR培地（NRM = CM異なるNRのNRM = CM）を加え、その後、30分ごとに染色/非染色PAFを2時間カウントすることにより、生存率を評価しました。 結果：結果として染色を伴うバイナリロジスティック回帰分析（はい/いいえ）対log濃度を伴うと、確率モデルを適合させることができ、染色卵胞の割合は、15μg/mL NRが使用された後、30分後に安定したままで、尾部の健康と生存率を妥協することなく使用できました。その結果、このプロトコルを使用して、硝酸化の前に染色の有意な効果はありませんでしたが、温暖化の直後または4日間の培養後すぐにPAFの生存率に発見されました。 結論：結論として、NR染色は、PAFのPAFの非侵襲的で非決定的な生存率評価ツールとして提案します。
目的：肥沃度の保存戦略は、生存可能な卵胞によって組み込まれた中性赤（NR）で染色するなど、前腹部卵胞（PAF）の非侵襲的実行可能性評価を保証します。手順を最適化するために、最初に、孤立したウシPAFの最適な生存率スクリーニングに必要な最低濃度と最短の暴露時間を決定しました。第二に、このプロトコルをガラス化手順と組み合わせて、染色された卵胞の極性耐性を評価しました。 方法：分離されたPAF（900、6回以上の複製）を、DMEM/HAMのF12（培地中-cm）で4日間（38.5°C、5％CO2）培養しました。D0、D2、およびD4では、卵胞を染色し、NR培地（NRM = CM異なるNRのNRM = CM）を加え、その後、30分ごとに染色/非染色PAFを2時間カウントすることにより、生存率を評価しました。 結果：結果として染色を伴うバイナリロジスティック回帰分析（はい/いいえ）対log濃度を伴うと、確率モデルを適合させることができ、染色卵胞の割合は、15μg/mL NRが使用された後、30分後に安定したままで、尾部の健康と生存率を妥協することなく使用できました。その結果、このプロトコルを使用して、硝酸化の前に染色の有意な効果はありませんでしたが、温暖化の直後または4日間の培養後すぐにPAFの生存率に発見されました。 結論：結論として、NR染色は、PAFのPAFの非侵襲的で非決定的な生存率評価ツールとして提案します。
PURPOSE: Fertility preservation strategies warrant non-invasive viability assessment of preantral follicles (PAF) such as staining with Neutral Red (NR) that is incorporated by viable follicles. To optimize the procedure, we firstly determined the lowest concentration and shortest exposure time needed for optimal viability screening of isolated bovine PAF. Secondly, we combined this protocol to a vitrification procedure to assess cryotolerance of the stained follicles. METHODS: Isolated PAF (900, divided over 6 replicates) were cultured in DMEM/Ham's F12 (Culture Medium - Cm) for 4 days (38.5 °C, 5% CO2). On D0, D2 and D4, follicles were stained, by adding NR medium (NRm = Cm with different concentrations NR) after which viability was assessed by counting stained/non-stained PAF every 30 min for a period of 2 h. RESULTS: Following a binary logistic regression analysis with staining as a result (yes/no) versus log-concentration, a probability model could be fitted, indicating that the proportion of stained follicles remained stable after 30 min when 15 μg/ml NR was used, without compromising follicular health and viability. Consequently, using this protocol, no significant effect of staining prior to vitrification, was found on PAF viability immediately after warming or following 4 days of culture. CONCLUSIONS: In conclusion, we propose NR staining as a non-invasive, non-detrimental viability assessment tool for PAF, when applied at 15 μg/ml for 30 min, being perfectly compatible with PAF vitrification.
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