プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM） - 極端なシーケンスCRISPR CAS9 DNAターゲット切断

クラスター化された定期的に散在する短いパリンドロミックリピート（CRISPR）関連酵素Cas9は、真核細胞でのゲノム編集に広く適応したRNA誘導ヌクレアーゼです。ただし、Cas9の生体内標的特異性はよく理解されており、ほとんどの研究は、潜在的なターゲット編集スペクトルを定義するために、シリコの予測に依存しています。クロマチン免疫沈降と続いてシーケンス（CHIP-seq）を使用して、TRP53遺伝子座をターゲットにした2つの異なる単一ガイド（SG）RNAによって誘導される触媒的に不活性なCAS9のゲノム全体の結合パノラマを描きます。CAS9：SGRNA複合体は、（5 '）ngg（3'）プロトススペーサー隣接モチーフ（PAM）に隣接する短い種子領域を持つ複数のサイトに積み込むことができます。しかし、変異状態を分析した種子領域を備えた43のチップセックサイトの中で、目的の標的軌跡と1つのターゲット部位でのみ編集が編集されています。ターゲット部位認識のin vitro分析により、ガイドの5 '端とPAM-distalターゲットシーケンス間の相互作用がCas9核分解活性を効率的に関与させるために必要であることが明らかになり、ターゲット編集がチップから予想よりも有意に低い理由の説明を提供します。SEQデータ。

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-associated enzyme Cas9 is an RNA-guided nuclease that has been widely adapted for genome editing in eukaryotic cells. However, the in vivo target specificity of Cas9 is poorly understood and most studies rely on in silico predictions to define the potential off-target editing spectrum. Using chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq), we delineate the genome-wide binding panorama of catalytically inactive Cas9 directed by two different single guide (sg) RNAs targeting the Trp53 locus. Cas9:sgRNA complexes are able to load onto multiple sites with short seed regions adjacent to (5')NGG(3') protospacer adjacent motifs (PAM). Yet among 43 ChIP-seq sites harboring seed regions analyzed for mutational status, we find editing only at the intended on-target locus and one off-target site. In vitro analysis of target site recognition revealed that interactions between the 5' end of the guide and PAM-distal target sequences are necessary to efficiently engage Cas9 nucleolytic activity, providing an explanation for why off-target editing is significantly lower than expected from ChIP-seq data.