口内疾患ウイルス3Aタンパク質の膜トポロジーと細胞ダイナミクス

足と口の病気ウイルス非構造タンパク質3Aは、ウイルスの複製、病原性、宿主範囲において重要な役割を果たします。それにもかかわらず、このタンパク質が異なる細胞成分で確立できる相互作用についてはほとんど知られていない。この作業では、完全な3A（GFP3A）とさまざまな3A変異を含むバージョンに融合した緑色蛍光タンパク質（GFP）を一時的に発現する細胞からin vivo動的研究を実施しました。結果は、分析されたほとんどの変異体で増加したGFP3Aのモバイル割合の存在と細胞質の連続コンパートメントの3Aの位置を明らかにしました。細胞分画のGFP3Aについても二重の挙動が観察され、細胞質ゾルおよび膜画分から等しく回収されたタンパク質であり、洗剤の存在下でも不溶性画分がさらに分別されたときにも観察された比率です。同様の結果が、RNA複製の開始に必要な3Aタンパク質前駆体であるGFP3ABBBの分別で観察されました。FMDV 3Aの非統合膜タンパク質トポロジーは、各タンパク質末端がグリコシル化アクセプタータグに融合した3Aのバージョンのグリコシル化の欠如と、プロテアーゼによる分解へのアクセス可能性によって支持されました。このモデルによれば、3Aは、ウイルスの複製に必要なウイルスと細胞タンパク質の相互作用が発生すると予想される、そのnおよびc-末端をサイトゾルにさらしている中心疎水性領域を介して膜と相互作用します。

Foot-and-mouth disease virus non-structural protein 3A plays important roles in virus replication, virulence and host-range; nevertheless little is known on the interactions that this protein can establish with different cell components. In this work, we have performed in vivo dynamic studies from cells transiently expressing the green fluorescent protein (GFP) fused to the complete 3A (GFP3A) and versions including different 3A mutations. The results revealed the presence of a mobile fraction of GFP3A, which was found increased in most of the mutants analyzed, and the location of 3A in a continuous compartment in the cytoplasm. A dual behavior was also observed for GFP3A upon cell fractionation, being the protein equally recovered from the cytosolic and membrane fractions, a ratio that was also observed when the insoluble fraction was further fractioned, even in the presence of detergent. Similar results were observed in the fractionation of GFP3ABBB, a 3A protein precursor required for initiating RNA replication. A nonintegral membrane protein topology of FMDV 3A was supported by the lack of glycosylation of versions of 3A in which each of the protein termini was fused to a glycosylation acceptor tag, as well as by their accessibility to degradation by proteases. According to this model 3A would interact with membranes through its central hydrophobic region exposing its N- and C- termini to the cytosol, where interactions between viral and cellular proteins required for virus replication are expected to occur.