ヒト疾患の好中球プロテイナーゼ3を視覚化およびブロックするための新しい選択的ペプチジルDI（クロロフェニル）ホスホン酸エステル

好中球プロテアーゼ3（PR3）の機能は、自己免疫性血管炎におけるその役割と細胞アポトーシスへの関与の可能性にもかかわらず、あまり理解されていません。これにより、その構造ホモロ​​グ好中球エラスターゼ（HNE）とは異なります。ヒト好中球セリンプロテアーゼの内因性阻害剤は、HNEを優先的に阻害し、それほど程度は低いPR3。PR3とHNEのS4サブサイトの好みを調査するために、単一レシド変異体PR3（I217R）を構築し、最適なペプチド基質配列を使用して、構造AC-ペプチジル（P）（O-C6H4-4-CLで選択的ホスホネート阻害剤を開発しました。）2。P4のプロリル残基とP2のアスパルティル残基の組み合わせは、PR3に対し​​て完全に選択的でした。次に、N末端でビオチン化ペプチジルホスホン酸塩を合成して、複雑な生物学的サンプルのPR3を同定しました。これらの阻害剤は、炎症性肺分泌物や膀胱癌患者の尿などの生物液中のタンパク質分解分解と急速に不活性化されたPR3に抵抗しました。これらの阻害剤の1つは、透過化された好中球および活性化細胞の表面で細胞内PR3を明らかにしました。それらは、低分子量にもかかわらず刺激された好中球の表面に結合したPR3をほとんど阻害しなかったため、膜結合PR3の立体構造と反応性が変化することを示唆しています。この発見は、自己抗体結合と、それに続く肉管炎（以前のウェゲナー疾患）を伴う肉芽腫症における好中球のその後の活性化に関連しています。これらは、さまざまな炎症性疾患のPR3活性を監視、検出、制御するプローブとして使用できる最初の阻害剤です。

The function of neutrophil protease 3 (PR3) is poorly understood despite of its role in autoimmune vasculitides and its possible involvement in cell apoptosis. This makes it different from its structural homologue neutrophil elastase (HNE). Endogenous inhibitors of human neutrophil serine proteases preferentially inhibit HNE and to a lesser extent, PR3. We constructed a single-residue mutant PR3 (I217R) to investigate the S4 subsite preferences of PR3 and HNE and used the best peptide substrate sequences to develop selective phosphonate inhibitors with the structure Ac-peptidyl(P)(O-C6H4-4-Cl)2. The combination of a prolyl residue at P4 and an aspartyl residue at P2 was totally selective for PR3. We then synthesized N-terminally biotinylated peptidyl phosphonates to identify the PR3 in complex biological samples. These inhibitors resisted proteolytic degradation and rapidly inactivated PR3 in biological fluids such as inflammatory lung secretions and the urine of patients with bladder cancer. One of these inhibitors revealed intracellular PR3 in permeabilized neutrophils and on the surface of activated cells. They hardly inhibited PR3 bound to the surface of stimulated neutrophils despite their low molecular mass, suggesting that the conformation and reactivity of membrane-bound PR3 is altered. This finding is relevant for autoantibody binding and the subsequent activation of neutrophils in granulomatosis with polyangiitis (formerly Wegener disease). These are the first inhibitors that can be used as probes to monitor, detect, and control PR3 activity in a variety of inflammatory diseases.