非癌性アミノ酸による非常に効率的なアンバー抑制のための進化した配列コンテキスト

非癌性アミノ酸（NCAA）による遺伝コードの拡大により、タンパク質の機能を高分子精度で調整することができます。このアプローチでは、NCAAはアミノアシル-TRNA-シンセターゼ（AAR）によって直交ナンセンスサプレッサーTRNAに充電され、リボソーム翻訳中のmRNAのナンセンスコドンの抑制によりin vivoで標的タンパク質に組み込まれます。センスコドンの翻訳と比較して、このプロセスは効率が低下して発生します。ただし、ナンセンスコドンのローカルシーケンスコンテキストが抑制効率にどのように影響するかは、まだよく理解されていません。ここでは、大腸菌で広く使用されているアンバーコドンの非常に効率的な抑制について、シーケンスコンテキストを報告します。Amberコドンの直接上流および下流の2つのランダムコドンで構成されるシーケンスコンテキストライブラリのin vivo選択は、特定のmRNAヌクレオチドおよび/またはアミノ酸を強い好みを持つコンテキストを提供しました。。このコンテキストは、タンパク質間で伝達可能であり、アンバーコドンのないコントロールタンパク質のレベルと比較して70〜110％のタンパク質発現レベルをもたらすNCAA依存性がほとんどない高いアンバー抑制効率を提供しました。これらのシーケンスコンテキストは、標準的な大腸菌株のタンパク質にNCAAを堅牢かつ非常に効率的に取り入れるための安定したタグを表し、標的遺伝子へのアンバーコドンのエンジニアリングのための一般的な設計ルールを提供します。

The expansion of the genetic code with noncanonical amino acids (ncAA) enables the function of proteins to be tailored with high molecular precision. In this approach, the ncAA is charged to an orthogonal nonsense suppressor tRNA by an aminoacyl-tRNA-synthetase (aaRS) and incorporated into the target protein in vivo by suppression of nonsense codons in the mRNA during ribosomal translation. Compared to sense codon translation, this process occurs with reduced efficiency. However, it is still poorly understood, how the local sequence context of the nonsense codon affects suppression efficiency. Here, we report sequence contexts for highly efficient suppression of the widely used amber codon in E. coli for the orthogonal Methanocaldococcus jannaschii tRNA(Tyr)/TyrRS and Methanosarcina mazei tRNA(Pyl)/PylRS pairs. In vivo selections of sequence context libraries consisting of each two random codons directly up- and downstream of an amber codon afforded contexts with strong preferences for particular mRNA nucleotides and/or amino acids that markedly differed from preferences of contexts obtained in control selections with sense codons. The contexts provided high amber suppression efficiencies with little ncAA-dependence that were transferrable between proteins and resulted in protein expression levels of 70-110% compared to levels of control proteins without amber codon. These sequence contexts represent stable tags for robust and highly efficient incorporation of ncAA into proteins in standard E. coli strains and provide general design rules for the engineering of amber codons into target genes.