限られたラット組織サンプルにおけるエヴァンスブルーの定量化の最適化

Evans Blue Dye（EBD）は、ヒト被験者の血漿量と動物モデルの血管透過性を測定する不活性トレーサーです。血液脳関門（BBB）の無傷の脳で外部染料が測定される場合など、サンプルの色素濃度が限られている場合、EBDの定量は困難になる可能性があります。ここで説明する手順では、サンプルの複製あたり非常に小さなボリューム（30 µL）を使用しました。これにより、標準の96ウェルプレートリーダーに基づいてEBD濃度のハイスループット測定が可能になりました。第一に、エタノールはそれぞれのウェルで一貫した光学経路の長さを確保し、EBD蛍光分光法の感度を大幅に向上させました。第二に、トリクロロ酢酸（TCA）は、生物学的溶質の結果として偽陽性EBD測定を除去し、上清に部分的に抽出したEBDを除去しました。さらに、in vitroおよびin vivoでラット血漿タンパク質EBD複合体から最適に抽出された50％TCA（[TCA最終] = 33.3％）の1：2体積比50％のTCAは、それぞれin vivoでラットの脳と肝臓から外出中抽出EBDを最適に抽出しました。この手順は、BBB-intact脳へのEBD血管外拡散の検出に特に役立ちますが、血管透過性がそれほど制限されていない組織への色素血管外拡張を検出するためにも適用できます。

Evans blue dye (EBD) is an inert tracer that measures plasma volume in human subjects and vascular permeability in animal models. Quantitation of EBD can be difficult when dye concentration in the sample is limited, such as when extravasated dye is measured in the blood-brain barrier (BBB) intact brain. The procedure described here used a very small volume (30 µl) per sample replicate, which enabled high-throughput measurements of the EBD concentration based on a standard 96-well plate reader. First, ethanol ensured a consistent optic path length in each well and substantially enhanced the sensitivity of EBD fluorescence spectroscopy. Second, trichloroacetic acid (TCA) removed false-positive EBD measurements as a result of biological solutes and partially extracted EBD into the supernatant. Moreover, a 1:2 volume ratio of 50% TCA ([TCA final] = 33.3%) optimally extracted EBD from the rat plasma protein-EBD complex in vitro and in vivo, and 1:2 and 1:3 weight-volume ratios of 50% TCA optimally extracted extravasated EBD from the rat brain and liver, respectively, in vivo. This procedure is particularly useful in the detection of EBD extravasation into the BBB-intact brain, but it can also be applied to detect dye extravasation into tissues where vascular permeability is less limiting.