LTB4によって誘導されるヒト好酸球のエキソサイトーシスには、BLT1のNOX2由来のROSを介した表面転座は不可欠です

背景：Leukotriene B4（LTB4）は、好酸球エキソサイトーシスを誘発する炎症誘発性脂質メディエーターであり、アレルギー性炎症を引き起こします。しかし、LTB4によって誘発される好酸球エキソサイトーシスの詳細な細胞内シグナル伝達メカニズムはあまり理解されていません。ここでは、LTB4によって誘導されたヒト好酸球のエキソサイトーシスには、NADPHオキシダーゼ（NOX）2由来の反応性酸素種（ROS）を介したBLT1の細胞表面への移動が必要であると報告しています。 方法：末梢血好酸球を精製し、LTB4で最大60分間刺激しました。LTB4刺激好酸球におけるBLT1依存性エキソサイトーシスにおけるNOX2由来ROSのシグナル伝達の役割を調査しました。 結果：LTB4で好酸球を刺激すると、BLT1を介したシグナル伝達を介したエキソサイトーシスマーカータンパク質CD63の細胞内ROS産生と表面上方制御が誘発されました。LTB4は、BLT1依存的にNOX2活性化に必要なP47（PHOX）リン酸化と91（PHOX）発現を誘導しました。ミトコンドリア阻害剤ではなく、NOX2阻害剤による前処理により、LTB4誘発ROS生成とエキソサイトーシスが予防されました。LTB4での刺激後30分で、細胞表面でのBLT1発現がアップレギュレートされました。BLT1のLTB4トリガー表面上方制御は、NOX2阻害剤によるROS生成の阻害によってもブロックされました。さらに、LTB4で30分間刺激すると、免疫沈降によるBLT1とNOX2と相互作用が発生しました。LTB4誘発ROS生成、BLT1の表面上方制御、およびエキソサイトーシスは、脂質ラフト破壊器、プロテインキナーゼC阻害剤、またはSRCキナーゼ阻害剤による前処理により阻害されました。 結論：これらの結果は、細胞表面へのNox2由来のROS媒介BLT1人身売買が、LTB4によって誘導されるヒト好酸球のエキソサイトーシスに重要な役割を果たすことを示唆しています。

BACKGROUND: Leukotriene B4 (LTB4) is a proinflammatory lipid mediator that elicits eosinophil exocytosis, leading to allergic inflammation. However, the detailed intracellular signaling mechanisms of eosinophil exocytosis induced by LTB4 are poorly understood. Herein, we report that NADPH oxidase (NOX)2-derived reactive oxygen species (ROS)-mediated BLT1 migration to the cell surface is required for exocytosis in human eosinophils induced by LTB4. METHODS: Peripheral blood eosinophils were purified and stimulated for up to 60 min with LTB4. The signaling role of NOX2-derived ROS in BLT1-dependent exocytosis in LTB4-stimulated eosinophils was investigated. RESULTS: Stimulating eosinophils with LTB4 induced intracellular ROS production and surface upregulation of the exocytosis marker protein CD63 via BLT1-mediated signaling. LTB4 induced p47(phox) phosphorylation and 91(phox) expression required for NOX2 activation in a BLT1-dependent manner. Pretreatment with NOX2 inhibitors, but not mitochondria inhibitor, prevented LTB4-induced ROS generation and exocytosis. At 30 min after stimulation with LTB4, BLT1 expression at the cell surface was upregulated. LTB4-triggered surface upregulation of BLT1 was also blocked by inhibition of ROS generation with NOX2 inhibitors. Moreover, stimulation for 30 min with LTB4 resulted in the interaction of BLT1 with NOX2 by immunoprecipitation. LTB4-induced ROS generation, surface upregulation of BLT1 and exocytosis was also inhibited by pretreatment with a lipid raft disruptor, protein kinase C inhibitor, or Src kinase inhibitor. CONCLUSION: These results suggest that NOX2-derived ROS-mediated BLT1 trafficking to the cell surface plays a key role in the exocytosis of human eosinophils induced by LTB4.