平滑筋ミオシンミオシン重鎖プロモーターにおけるGCリプレッサー要素のDNAメチル化は、ノッチ関連転写因子RBPJ/CSL1の結合を促進します

目的：本研究の目標は、平滑筋細胞（SMC）分化マーカー遺伝子発現を調節する新しいメカニズムを特定することでした。 アプローチと結果：多くのSMC固有のプロモーターの炭水化物を含む領域がCPG島内に埋め込まれていることを実証します。SMミオシン重鎖（MHC）プロモーターの以前に特定されたGCリプレッサー要素は、培養された大動脈SMCで高度にメチル化されていましたが、大動脈ではなく、この違いはSM MHC発現と逆相関していました。アフィニティクロマトグラフィー/質量分析ベースのアプローチを使用して、免疫グロブリンκJ領域（RBPJ）の多機能ノッチ転写因子、再結合シグナル結合タンパク質（RBPJ）をメチル化GCリプレッサー結合タンパク質として特定しました。RBPJタンパク質レベルと内因性SM MHC GCリプレッサーへの結合は、血小板由来の成長因子BB治療によって強化されました。RBPJ結合を促進したGCリプレッサーへのメチル化模倣変異は、RBPJの過剰発現と同様にSM MHCプロモーター活性を阻害しました。これと一致して、表現型で調節されたヒト大動脈SMCを強化した内因性SMCマーカー遺伝子発現におけるRBPJのノックダウン。対照的に、分化した形質転換成長因子-β処理SMCにおけるRBPJの枯渇は、SMC特異的遺伝子活性化を阻害し、RBPJ/Notchシグナル伝達の効果がコンテキストに依存しているという考えをサポートします。 結論：我々の結果は、RBPJのGCリプレッサー要素へのメチル化依存性結合がSM MHCプロモーター活性を負に調節することができ、RBPJが表現型で調節されたSMCにおけるSMCマーカー遺伝子発現を阻害できることを示しています。これらの結果は、SMC表現型の調節とノッチ依存性転写に重要な意味を持ちます。

OBJECTIVE: The goal of the present study was to identify novel mechanisms that regulate smooth muscle cell (SMC) differentiation marker gene expression. APPROACH AND RESULTS: We demonstrate that the CArG-containing regions of many SMC-specific promoters are imbedded within CpG islands. A previously identified GC repressor element in the SM myosin heavy chain (MHC) promoter was highly methylated in cultured aortic SMC but not in the aorta, and this difference was inversely correlated with SM MHC expression. Using an affinity chromatography/mass spectroscopy-based approach, we identified the multifunctional Notch transcription factor, recombination signal binding protein for immunoglobulin κ J region (RBPJ), as a methylated GC repressor-binding protein. RBPJ protein levels and binding to the endogenous SM MHC GC repressor were enhanced by platelet-derived growth factor-BB treatment. A methylation mimetic mutation to the GC repressor that facilitated RBPJ binding inhibited SM MHC promoter activity as did overexpression of RBPJ. Consistent with this, knockdown of RBPJ in phenotypically modulated human aortic SMC enhanced endogenous SMC marker gene expression, an effect likely mediated by increased recruitment of serum response factor and Pol II to the SMC-specific promoters. In contrast, the depletion of RBPJ in differentiated transforming growth factor-β-treated SMC inhibited SMC-specific gene activation, supporting the idea that the effects of RBPJ/Notch signaling are context dependent. CONCLUSIONS: Our results indicate that methylation-dependent binding of RBPJ to a GC repressor element can negatively regulate SM MHC promoter activity and that RBPJ can inhibit SMC marker gene expression in phenotypically modulated SMC. These results will have important implications on the regulation of SMC phenotype and on Notch-dependent transcription.