HPV E1ヘリカーゼの核細胞質シャトリングと、細胞の増殖とDNA損傷応答の誘導に対するその効果を評価する方法

感染細胞の核におけるヒトパピローマウイルス（HPV）二本鎖DNAゲノムの複製は、宿主DNA複製機械と併せてウイルスタンパク質E1およびE2に依存しています。このプロセスは、一部のサイクリン依存性リン酸化を介して細胞DNAの複製に密接にリンクしており、E1のサイクリン依存性リン酸化は、核からの輸出を阻害して、S期中のこのコンパートメントでの蓄積を促進します。最近、核内でのE1の蓄積は、ウイルスDNA複製の前提条件であり、細胞増殖の阻害とDNA損傷応答（DDR）の活性化につながることが示されています。ここでは、E1の細胞内局在を監視し、コロニー形成アッセイ、免疫蛍光微小コピー、フローサイトメトリーアプローチの組み合わせを使用して、細胞の増殖、細胞周期の進行、およびDDRの誘導に対する核蓄積の有害な効果を評価する方法について説明します。

Replication of the human papillomavirus (HPV) double-stranded DNA genome in the nucleus of infected cells relies on the viral proteins E1 and E2 in conjunction with the host DNA replication machinery. This process is tightly linked to the replication of cellular DNA, in part through the cyclin-dependent phosphorylation of E1, which inhibits its export out of the nucleus to promote its accumulation in this compartment during S-phase. It has been recently shown that accumulation of E1 in the nucleus, while a prerequisite for viral DNA replication, leads to the inhibition of cellular proliferation and the activation of a DNA damage response (DDR). Here we describe methods to monitor the subcellular localization of E1 and to assess the deleterious effects of its nuclear accumulation on cellular proliferation, cell cycle progression and the induction of a DDR, using a combination of colony formation assays, immunofluorescence microcopy, and flow cytometry approaches.