C型肝炎ウイルス（HCV）プロトタイプ株HCV-1およびH77の効率的な感染細胞培養システム

非標識：最初に発見され、シーケンスされたC型肝炎ウイルス（HCV）ゲノムと、最初のin vivo感染性HCVクローンは、HCVプロトタイプ株HCV-1とH77にそれぞれ発生しました。本研究では、in vivo感染性クローンでHCV-1/SF9_AおよびH77Cを使用して、これらの遺伝子型1A株の効率的な感染細胞培養システムを開発しました。最初に、HCV-1 5'utr-NS5a（UTRが翻訳されていない領域を表す）およびJFH1 NS5B-3'UTR（5-5A組換え）を含むゲノムを適応させました。（LSG）、HUH7.5細胞で効率的に成長し、E2変異S399Fを識別します。LSG/S399Fと報告されたTNCC（1A）適応変異A1226G/Q1773H/N1927T/Y2981F/F2994Sの組み合わせにより、全長HCV-1クローンの適応が促進されました。17の突然変異（HCV1CC）を伴うHCV-1組換えは、Huh7.5細胞で効率的に複製し、10（4.0）フォーカスフォーミングユニット（FFU）/mlの上清感染性力価を生成しました。これらの突然変異のうち8つは、継続したHCV-1ウイルスから特定され、A970T/I1312V/C2419R/A2919T変異は感染性粒子産生に不可欠でした。CD81欠損HUH7細胞を使用して、ウイルスアセンブリのA970T/I1312V/A2919TまたはA970T/C2419R/A2919Tの重要性と、I1312V/C2419Rの組み合わせがウイルス放出で大きな役割を果たしたことをさらに実証しました。同様のアプローチを使用して、ここでは、培養適応フルレングスTNウイルスと、生存可能なH77CおよびHCV-1 5-5A組換え因子、開始された培養適応に由来する一般的なNS3ヘリカーゼ変異（S1368P）からここで特定されたNS5B変異F2994Rが確認されていることがわかりました。LSGおよびTNCC（1A）適応変異を含むH77Cの。トランスフェクションおよびその後のナイーブHUH7.5細胞の感染後に効率的に複製および拡散した19の変異（H77CCC）を抱いたH77C組換え剤は、それぞれ10（3.5）および10（4.4）FFU/mlの力価に達しました。 重要性：C型肝炎ウイルス（HCV）は、1989年にプロトタイプ株HCV-1ゲノムのクローニングで発見されました。1997年、他のHCVプロトタイプ株であるH77の2つの分子クローンは、チンパンジーで感染性であることが示されましたが、in vitroではそうではありませんでした。HCVの研究は、HUH7.5細胞に感染を確立できるゲノムであるJFH1（遺伝子型2A）の発見により、2005年にのみ利用可能になる感染性細胞培養システムの不足によって妨げられました。最近、重要な適応変異を特定することにより、遺伝子型1a（TN）、2A（J6）、および2B（J8、DH8、およびDH10）株のin vitro感染性クローンを開発しました。グローバルに、遺伝子型1が最も一般的です。HCV-1およびH77プロトタイプシーケンスを使用した研究は、HCVに関する重要な知識を生み出しています。したがって、これらの1A株のためにここで開発されたin vitro感染性クローンは、HCV研究の進歩に特に価値があります。さらに、私たちの調査結果は、異なる遺伝子型のHCV分離株の培養適応のための新しい道を開きます。

UNLABELLED: The first discovered and sequenced hepatitis C virus (HCV) genome and the first in vivo infectious HCV clones originated from the HCV prototype strains HCV-1 and H77, respectively, both widely used in research of this important human pathogen. In the present study, we developed efficient infectious cell culture systems for these genotype 1a strains by using the HCV-1/SF9_A and H77C in vivo infectious clones. We initially adapted a genome with the HCV-1 5'UTR-NS5A (where UTR stands for untranslated region) and the JFH1 NS5B-3'UTR (5-5A recombinant), including the genotype 2a-derived mutations F1464L/A1672S/D2979G (LSG), to grow efficiently in Huh7.5 cells, thus identifying the E2 mutation S399F. The combination of LSG/S399F and reported TNcc(1a)-adaptive mutations A1226G/Q1773H/N1927T/Y2981F/F2994S promoted adaptation of the full-length HCV-1 clone. An HCV-1 recombinant with 17 mutations (HCV1cc) replicated efficiently in Huh7.5 cells and produced supernatant infectivity titers of 10(4.0) focus-forming units (FFU)/ml. Eight of these mutations were identified from passaged HCV-1 viruses, and the A970T/I1312V/C2419R/A2919T mutations were essential for infectious particle production. Using CD81-deficient Huh7 cells, we further demonstrated the importance of A970T/I1312V/A2919T or A970T/C2419R/A2919T for virus assembly and that the I1312V/C2419R combination played a major role in virus release. Using a similar approach, we found that NS5B mutation F2994R, identified here from culture-adapted full-length TN viruses and a common NS3 helicase mutation (S1368P) derived from viable H77C and HCV-1 5-5A recombinants, initiated replication and culture adaptation of H77C containing LSG and TNcc(1a)-adaptive mutations. An H77C recombinant harboring 19 mutations (H77Ccc) replicated and spread efficiently after transfection and subsequent infection of naive Huh7.5 cells, reaching titers of 10(3.5) and 10(4.4) FFU/ml, respectively. IMPORTANCE: Hepatitis C virus (HCV) was discovered in 1989 with the cloning of the prototype strain HCV-1 genome. In 1997, two molecular clones of H77, the other HCV prototype strain, were shown to be infectious in chimpanzees, but not in vitro. HCV research was hampered by a lack of infectious cell culture systems, which became available only in 2005 with the discovery of JFH1 (genotype 2a), a genome that could establish infection in Huh7.5 cells. Recently, we developed in vitro infectious clones for genotype 1a (TN), 2a (J6), and 2b (J8, DH8, and DH10) strains by identifying key adaptive mutations. Globally, genotype 1 is the most prevalent. Studies using HCV-1 and H77 prototype sequences have generated important knowledge on HCV. Thus, the in vitro infectious clones developed here for these 1a strains will be of particular value in advancing HCV research. Moreover, our findings open new avenues for the culture adaptation of HCV isolates of different genotypes.