ヌクレオシド三リン酸ジフォスホヒドロラーゼ（NTPDase）活性を監視するための蛍光分極免疫測定法

外核ヌクレオシドトリホスホスホヒドロラーゼファミリーの次のメンバー、NTPDase1（CD39）、NTPDase -2、-3、および-8は、細胞外核質レベルを調節することにより、プリン作動性シグナル伝達において重要な役割を果たします。強力かつ選択的なNTPDase阻害剤は、薬理学的ツールとして必要であり、新しい薬物として潜在的です。抗癌および抗菌療法の場合。天然基質（ATPまたはADP）を使用して、高速で敏感なNTPDase蛍光偏光（FP）免疫測定法を開発しました。NtpDase1触媒反応中に、基質はADPに脱リン酸化され、さらに脱リン酸化されたAMPが最終生成物としてAMPを生成します（NTPDase1による）。NtpDase3および-8はAMPとADPを生成しますが、NTPDase2は主にADPの形成になります。それぞれの製品であるAMPまたはADPの直接的な定量化は、蛍光偏光の変化につながる特定の抗体からの適切な蛍光トレーサーヌクレオチドの変位によって達成されます。アッセイは非常に感度が高く、NTPDaseのKM値よりも低い基質濃度（20μMATPまたは10μMADP）で実行でき、新しい競合阻害剤の同定を簡素化します。最適化された抗体および酵素濃度により、2μMADPおよび1μMAMP（10％基質変換）の再現性検出が可能になります。アッセイの検証により、調査対象のすべてのNTPDaseサブタイプで0.70を超える優れたZ'ファクターが得られ、分析方法の高い堅牢性が示されました。さらに、標準阻害剤をテストし、400を超える化合物（Z'ファクター：0.87、ヒット率0.5％）で構成されるライブラリを使用して、最初の例示的なスクリーニングキャンペーンを実行しました。これにより、384ウェル形式でのIC50値決定とハイスループットスクリーニングのFPアッセイの適合性を実証しました。新しいFPアッセイは、現在の標準アッセイよりも優れていることが示されました。

The following members of the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family, NTPDase1 (CD39), NTPDase-2, -3, and -8, play an important role in purinergic signal transduction by regulating extracellular nucleotide levels. Potent and selective NTPDase inhibitors are required as pharmacological tools and have potential as novel drugs, e.g. for anti-cancer and anti-bacterial therapy. We have developed fast and sensitive NTPDase fluorescence polarization (FP) immunoassays using the natural substrates (ATP or ADP). During the NTPDase1-catalyzed reaction, the substrate is dephosphorylated to ADP which is further dephosphorylated yielding AMP as the final product (by NTPDase1). NTPDase3 and -8 yield AMP and ADP, while NTPDase2 results mainly in the formation of ADP. Direct quantification of the respective product, AMP or ADP, is achieved by displacement of an appropriate fluorescent tracer nucleotide from a specific antibody leading to a change in fluorescence polarization. The assays are highly sensitive and can be performed with low substrate concentrations (20 μM ATP or 10 μM ADP) below the KM values of NTPDases, which simplifies the identification of novel competitive inhibitors. Optimized antibody and enzyme concentrations allow the reproducible detection of 2 μM ADP and 1 μM AMP (at 10% substrate conversion). Validation of the assays yielded excellent Z'-factors greater than 0.70 for all investigated NTPDase subtypes indicating high robustness of the analytical method. Furthermore, we tested a standard inhibitor and performed a first exemplary screening campaign with a library consisting of >400 compounds (Z'-factor: 0.87, hit rate 0.5%). Thereby we demonstrated the suitability of the FP assay for IC50 value determination and high-throughput screening in a 384-well format. The new FP assays were shown to be superior to current standard assays.