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CRISPR-CAS9システムは、遺伝子編集およびゲノム全体のスクリーニングアプリケーションに大きな可能性を秘めた、部位固有のターゲット可能なDNAヌクレアーゼで構成されています。CRISPR-CAS9システムをこれらのアッセイに正常に適用するには、CAS9がDNAを誘導する速度が望ましくない遺伝子座で破壊される速度を理解する必要があります。2つのヒトおよび1つのマウス細胞株における典型的なCAS9実験におけるCAS9オフターゲット活性の速度を特徴づけました。ターゲット部位の両方で12 GRNAのCAS9切断活動と、GRNAあたりの約90の予測オフターゲット部位の両方で分析しました。CAS9ベースのノックアウト実験では、GRNAは、すべてのターゲット部位と、ヒト293フィート、ヒト誘発性多能性幹細胞、およびマウス胚性幹細胞におけるゲノム全体でいくつかのターゲットオフターゲット部位のみで検出可能なCAS9切断活性を誘導しました。（es）細胞。切断速度とDNA修復パターンの両方が、ターゲットおよびターゲット外部の両方の2つのヒト細胞株間で高度に相関していました。マウスES細胞におけるクローンCAS9切断分析では、標的性の低い活性が低いことで、バイアレン性CAS9切断が観察されました。我々の結果は、CAS9のオフターゲット活性が低く、GRNAと潜在的なオフターゲット部位の間の配列同一性の程度によって予測可能であることを示しています。オフターゲットCAS9アクティビティは、ほぼ相補性のオフターゲット部位がほとんどないGRNAを選択することで最小限に抑えることができます。
CRISPR-CAS9システムは、遺伝子編集およびゲノム全体のスクリーニングアプリケーションに大きな可能性を秘めた、部位固有のターゲット可能なDNAヌクレアーゼで構成されています。CRISPR-CAS9システムをこれらのアッセイに正常に適用するには、CAS9がDNAを誘導する速度が望ましくない遺伝子座で破壊される速度を理解する必要があります。2つのヒトおよび1つのマウス細胞株における典型的なCAS9実験におけるCAS9オフターゲット活性の速度を特徴づけました。ターゲット部位の両方で12 GRNAのCAS9切断活動と、GRNAあたりの約90の予測オフターゲット部位の両方で分析しました。CAS9ベースのノックアウト実験では、GRNAは、すべてのターゲット部位と、ヒト293フィート、ヒト誘発性多能性幹細胞、およびマウス胚性幹細胞におけるゲノム全体でいくつかのターゲットオフターゲット部位のみで検出可能なCAS9切断活性を誘導しました。（es）細胞。切断速度とDNA修復パターンの両方が、ターゲットおよびターゲット外部の両方の2つのヒト細胞株間で高度に相関していました。マウスES細胞におけるクローンCAS9切断分析では、標的性の低い活性が低いことで、バイアレン性CAS9切断が観察されました。我々の結果は、CAS9のオフターゲット活性が低く、GRNAと潜在的なオフターゲット部位の間の配列同一性の程度によって予測可能であることを示しています。オフターゲットCAS9アクティビティは、ほぼ相補性のオフターゲット部位がほとんどないGRNAを選択することで最小限に抑えることができます。
The CRISPR-Cas9 system consists of a site-specific, targetable DNA nuclease that holds great potential in gene editing and genome-wide screening applications. To apply the CRISPR-Cas9 system to these assays successfully, the rate at which Cas9 induces DNA breaks at undesired loci must be understood. We characterized the rate of Cas9 off-target activity in typical Cas9 experiments in two human and one mouse cell lines. We analyzed the Cas9 cutting activity of 12 gRNAs in both their targeted sites and ∼90 predicted off-target sites per gRNA. In a Cas9-based knockout experiment, gRNAs induced detectable Cas9 cutting activity in all on-target sites and in only a few off-target sites genome-wide in human 293FT, human-induced pluripotent stem (hiPS) cells, and mouse embryonic stem (ES) cells. Both the cutting rates and DNA repair patterns were highly correlated between the two human cell lines in both on-target and off-target sites. In clonal Cas9 cutting analysis in mouse ES cells, biallelic Cas9 cutting was observed with low off-target activity. Our results show that off-target activity of Cas9 is low and predictable by the degree of sequence identity between the gRNA and a potential off-target site. Off-target Cas9 activity can be minimized by selecting gRNAs with few off-target sites of near complementarity.
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