オンチップセレックスを使用して、グリケーションヘモグロビンと総ヘモグロビンに特異的なアプタマーの選択

過去3か月間の平均グルコース濃度を反映する血液糖化ヘモグロビン（HBA1C）レベルは、糖尿病の診断、監視、リスク評価の基本です。小さな薬物、代謝物、またはタンパク質からの多種多様な分子に対する高い親和性を示す一本鎖DNAまたはRNAであるアプタマーは、HBA1cの測定に使用できるという仮説があります。アプタマーは、指数濃縮（SELEX）によりリガンドの系統的進化と呼ばれるin vitroプロセスを通じて選択され、比較的低コストで高い再現性で化学的に合成できます。したがって、この研究は、オンチップSELEXプロトコルを使用して、HBA1Cおよびヘモグロビン（HB）固有の一本鎖DNAアプタマーを選択することを目的としています。Microfluidic Selexチップが開発され、Hba1cおよびHbの特定のアプタマーをスクリーニングするために、複数のラウンドのSELEXを継続的かつ自動的に実行しました。HBA1CとHBは、最初に磁気ビーズにコーティングされました。ランダム化された40MER DNAライブラリーを使用したいくつかのラウンドの選択と濃縮に続いて、特定のオリゴヌクレオチドが選択されました。結合の特異性と親和性は、競合アッセイと結合アッセイによって評価されました。開発されたマイクロ流体システムを使用して、インキュベーションと分割時間が大幅に減少し、プロセス全体が劇的に短縮されました。マイクロ流体システムによって選択されたHBA1CおよびHB特異的アプタマーの両方が、高い特異性と親和性を示しました（解離定数、KD = 7.6±3.0 nmおよび7.3±2.2 nmでそれぞれHBA1CおよびHB）。アッセイをさらに改良することで、これらのアプタマーは、近い将来、in vitro診断アプリケーションの従来の抗体を置き換える可能性があります。

Blood glycated hemoglobin (HbA1c) levels reflecting average glucose concentrations over the past three months are fundamental for the diagnosis, monitoring, and risk assessment of diabetes. It has been hypothesized that aptamers, which are single-stranded DNAs or RNAs that demonstrate high affinity to a large variety of molecules ranging from small drugs, metabolites, or proteins, could be used for the measurement of HbA1c. Aptamers are selected through an in vitro process called systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), and they can be chemically synthesized with high reproducibility at relatively low costs. This study therefore aimed to select HbA1c- and hemoglobin (Hb)-specific single-stranded DNA aptamers using an on-chip SELEX protocol. A microfluidic SELEX chip was developed to continuously and automatically carry out multiple rounds of SELEX to screen specific aptamers for HbA1c and Hb. HbA1c and Hb were first coated onto magnetic beads. Following several rounds of selection and enrichment with a randomized 40-mer DNA library, specific oligonucleotides were selected. The binding specificity and affinity were assessed by competitive and binding assays. Using the developed microfluidic system, the incubation and partitioning times were greatly decreased, and the entire process was shortened dramatically. Both HbA1c- and Hb-specific aptamers selected by the microfluidic system showed high specificity and affinity (dissociation constant, Kd = 7.6 ± 3.0 nM and 7.3 ± 2.2 nM for HbA1c and Hb, respectively). With further refinements in the assay, these aptamers may replace the conventional antibodies for in vitro diagnostics applications in the near future.