馬CYP3A94の異種発現と、共発現NADPH P450酸化還元酵素レベルを調節するための調整可能なシステムの調査

シトクロムP450酵素の活性は、酵素NADPH P450酸化還元酵素（POR）に依存します。この研究の目的は、哺乳類細胞のPORタンパク質レベルを調節できるシステムを使用して、馬CYP3A94の活性を調査することでした。CYP3A94と馬のPORは、V79細胞で異種の発現を行いました。使用されているシステムでは、PORタンパク質調節は、融合タンパク質に不安定性を伝達する不安定なドメイン（DD）に基づいています。したがって、得られた融合タンパク質は、ユビキチンプロテアソーム系（UPS）によって分解されます。「Shield-1」を追加すると、DD融合タンパク質が分解を防ぎます。異なるシールド-1濃度でのPORレベルの変化は、シトクロムCの減少、西洋の免疫ブロット分析、および免疫細胞化学によって実証されました。CYP3A94活性の変化は、CYP3A4活性を検出することが知られている基質（BFC）を使用して調査されました。馬CYP3A94は代謝的に活性であることが実証されており、その活性はPORの共発現によって大幅に上昇する可能性があります。V79-CYP3A94細胞と比較して、V79-CYP3A94/DD-POR細胞では、シトクロムCの減少が有意に増加しました。驚くべきことに、異なるシールド-1濃度とのインキュベーションは、西部の免疫ブロット分析によって示されるPORタンパク質の減少をもたらしました。シトクロムCの減少は大幅に変化しませんでしたが、CYP3A94活性は、500 nmおよび1 µMシールド1とのインキュベーション後、24時間4倍以上減少しました。Shield-1を伴うまたは伴わないV79-CYP3A94 POR細胞を比較した場合、違いは得られませんでした。V79-CYP3A94/DD-POR細胞の基礎活性レベルは予期せず高く、DD/PORがシールド-1なしで分解されないことを示しています。SHIELD-1は、PORタンパク質レベルとCYP3A94活性を低下させ、SHIELD-1が未知のメカニズムによってPOR活性を損なう可能性があることを示唆しています。PPTUNERシステムによるPORの調節は取得できませんでしたが、CYP活性は共発現PORで大幅に増強されたため、細胞株V79-CYP3A94/DD-PORシステムをさらに実験に使用するために使用できます。

The activity of cytochrome P450 enzymes depends on the enzyme NADPH P450 oxidoreductase (POR). The aim of this study was to investigate the activity of the equine CYP3A94 using a system that allows to regulate the POR protein levels in mammalian cells. CYP3A94 and the equine POR were heterologously expressed in V79 cells. In the system used, the POR protein regulation is based on a destabilizing domain (DD) that transfers its instability to a fused protein. The resulting fusion protein is therefore degraded by the ubiquitin-proteasome system (UPS). Addition of "Shield-1" prevents the DD fusion protein from degradation. The change of POR levels at different Shield-1 concentrations was demonstrated by cytochrome c reduction, Western immunoblot analysis, and immunocytochemistry. The alteration of CYP3A94 activity was investigated using a substrate (BFC) known to detect CYP3A4 activity. Equine CYP3A94 was demonstrated to be metabolically active and its activity could be significantly elevated by co-expression of POR. Cytochrome c reduction was significantly increased in V79-CYP3A94/DD-POR cells compared to V79-CYP3A94 cells. Surprisingly, incubation with different Shield-1 concentrations resulted in a decrease in POR protein shown by Western immunoblot analysis. Cytochrome c reduction did not change significantly, but the CYP3A94 activity decreased more than 4-fold after incubation with 500 nM and 1 µM Shield-1 for 24 hours. No differences were obtained when V79-CYP3A94 POR cells with and without Shield-1 were compared. The basal activity levels of V79-CYP3A94/DD-POR cells were unexpectedly high, indicating that DD/POR is not degraded without Shield-1. Shield-1 decreased POR protein levels and CYP3A94 activity suggesting that Shield-1 might impair POR activity by an unknown mechanism. Although regulation of POR with the pPTuner system could not be obtained, the cell line V79-CYP3A94/DD-POR system can be used for further experiments to characterize the equine CYP3A94 since the CYP activity was significantly enhanced with co-expressed POR.