誘導性多能性幹細胞のレンチウイルス変換のための効率的なバイオテクノロジーアプローチ

誘導された多能性幹（IPS）細胞は、それらを再プログラミングすることにより、分化した成体体細胞から生成されます。無制限の自己再生、およびあらゆる細胞型に分化する可能性により、IPS細胞は基本および臨床研究の候補を非常に有望にします。さらに、IPS細胞は、治療ツールとして使用するために遺伝的に操作できます。DNAは、レンチウイルスベクターを使用してIPS細胞に導入できます。これは、トランスジェンの効率的な形質導入と安定した統合のための有用な選択を表しています。この研究では、IPS細胞のレンチウイルス形質導入の2つの方法、すなわち懸濁方法と吊り下げドロップ法を比較します。従来のサスペンション法とは対照的に、吊り下げドロップ法、胚性体（EB）の形成と形質導入が同時に発生します。IPS細胞を培養してEBSを形成し、その後、従来の懸濁液法と吊り下げ滴法を使用してレンチウイルスで導入し、miR-128および緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現しました。導入された細胞の数は、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーによって評価されました。MTTアッセイとリアルタイムPCRを実行して、それぞれ細胞生存率と導入遺伝子発現を決定しました。形態学的には、GFP+細胞は吊り下げ滴法でより検出可能であり、この発見はフローサイトメトリー分析によって定量化されました。MTTアッセイの結果によると、細胞生存率は吊り下げ滴法でかなり高く、リアルタイムPCRは、滴でレンチウイルスで導入されたIPS細胞でmiR-128のより高い相対発現を表しています。全体として、吊り下げドロップ法を使用した挑戦的なIPS細胞のレンチウイルス形質導入は、従来の懸濁方法よりも毒性が少ない遺伝子移動に適した十分な戦略を提供するようです。

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from differentiated adult somatic cells by reprogramming them. Unlimited self-renewal, and the potential to differentiate into any cell type, make iPS cells very promising candidates for basic and clinical research. Furthermore, iPS cells can be genetically manipulated for use as therapeutic tools. DNA can be introduced into iPS cells, using lentiviral vectors, which represent a helpful choice for efficient transduction and stable integration of transgenes. In this study, we compare two methods of lentiviral transduction of iPS cells, namely, the suspension method and the hanging drop method. In contrast to the conventional suspension method, in the hanging drop method, embryoid body (EB) formation and transduction occur concurrently. The iPS cells were cultured to form EBs, and then transduced with lentiviruses, using the conventional suspension method and the hanging drop method, to express miR-128 and green fluorescent protein (GFP). The number of transduced cells were assessed by fluorescent microscopy and flow cytometry. MTT assay and real-time PCR were performed to determine the cell viability and transgene expression, respectively. Morphologically, GFP+ cells were more detectable in the hanging drop method, and this finding was quantified by flow cytometric analysis. According to the results of the MTT assay, cell viability was considerably higher in the hanging drop method, and real-time PCR represented a higher relative expression of miR-128 in the iPS cells introduced with lentiviruses in drops. Altogether, it seems that lentiviral transduction of challenging iPS cells using the hanging drop method offers a suitable and sufficient strategy in their gene transfer, with less toxicity than the conventional suspension method.