細胞内の総チオール、タンパク質チオール、および非タンパク質チオールの同時相対定量のための迅速かつチオール特異的ハイスループットアッセイ

生物学的分子のチオール基は、さまざまな生理学的機能と病理学的条件において重要な役割を果たします。チオールは、タンパク質チオールと非タンパク質チオールの2つの主要なグループに分けられます。チオールアッセイには多くの方法が報告されています。これらの方法のほとんどは、細胞タンパク質チオールがグルタチオンよりも豊富であるという事実にもかかわらず、主要な非タンパク質チオールであるグルタチオンのために開発されています。さらに、これらの方法には通常、生物学的サンプル調製のプロセスとそれに続く分離方法が含まれ、時間がかかります。以前に、一連のチオール特異的蛍光酸硫化物を報告しました。これらの非蛍光ベンゾフラザン硫化物は、強い蛍光チオール付加物を形成するために、チオールと具体的に迅速かつ特に反応します。硫化物の急速な反応、チオール特異的、および蛍光性の性質は、蛍光顕微鏡を介して生細胞の総チオールの相対的な定量のために硫化物の1つを適用することに成功しました。この作業では、同じ化合物を使用して、タンパク質チオール、非タンパク質チオール、および蛍光マイクロプレートリーダーの96ウェルプレートの細胞内のタンパク質チオール、非タンパク質チオール、および総チオールを同時にモニタリングするための最初のハイスループット法を開発しました。NMとλ（EM）= 520 nm。この方法は迅速かつ敏感であり、HPLCチオールアッセイ法によって検証されています。この方法は、500細胞/ウェルの低い細胞濃度でチオールを検出できます。また、この方法では、細胞チオールレベルの変化を容易に監視できることも実証しました。この方法は、異なるチオール付加物の蛍光強度が変化するため、チオールの絶対定量を提供することはできませんが、コントロールと比較して相対的な定量化の正確な測定を提供します。この方法は、チオール関連の生物医学/医薬品研究の貴重なツールになります。

Thiol groups in biological molecules play a significant role in various physiological functions and pathological conditions. Thiols are divided into two major groups: protein thiols and nonprotein thiols. Numerous methods have been reported for thiol assays. Most of these methods have been developed for glutathione, the principal nonprotein thiol, despite the fact that cellular protein thiols are more abundant than glutathione. Further, these methods usually involve a process of biological sample preparation followed by a separation method, and they are time-consuming. We reported previously a series of thiol-specific fluorogenic benzofurazan sulfides. These nonfluorescent benzofurazan sulfides react rapidly and specifically with a thiol to form a strong fluorescent thiol adduct. The rapid reaction, thiol-specific and fluorogenic nature of the sulfides successfully yielded an application of one of the sulfides for relative quantitation of total thiols in live cells through fluorescence microscopy. In this work, we employed the same compound to develop the first high-throughput method for simultaneous monitoring of protein thiols, nonprotein thiols, and total thiols in cells in a 96-well plate on a fluorescence microplate reader at λ(ex) = 430 nm and λ(em) = 520 nm, respectively. The method is rapid and sensitive, and has been validated by an HPLC thiol assay method. The method can detect thiols with cell concentrations as low as 500 cells/well. We also demonstrated that the method can readily monitor changes in cellular thiol levels. Although the method cannot provide an absolute quantification for thiols because fluorescence intensity of different thiol adducts varies, it provides an accurate measurement of relative quantification, relative to the control. The method will be a valuable tool in thiol-related biomedical/pharmaceutical research.